Biosensores cianobacterianos, una solución de futuro para la monitorización ‘in situ’ de la calidad de las aguas

La contaminación del agua es un problema mundial que requiere la implementación de soluciones para la caracterización y el tratamiento. Pero para decidir la mejor solución, primero hay que identificar la magnitud del problema. En este contexto, desde hace décadas, los técnicos utilizan como herramientas el análisis químico y los bioensayos de toxicidad. En el caso del medio acuático se emplean organismos relevantes como las cianobacterias, que responden a la pregunta: ¿la muestra es tóxica?. Una evolución de estos bioensayos de toxicidad es el uso de biosensores. Entre ellos, las cepas basadas en cianobacterias tienen especial relevancia debido a su papel como productores primarios en la cadena trófica. A pesar de ser una herramienta muy útil en el campo de la ecotoxicología, son muy escasos los biosensores cianobacterianos construidos hasta la fecha. En este artículo se comentan brevemente las cepas biorreporteras construidas, así como las mejoras necesarias para su uso in situ.

Jara Hurtado-Gallego. Ingeniería Química. Universidad de Alcalá
En las últimas décadas, la calidad del agua se ha visto afectada por el continuo vertido de contaminantes. Este deterioro es un problema mundial que requiere la mejora de la monitorización, y la implementación de soluciones en el tratamiento y remediación.

Existe la necesidad de monitoreo de contaminantes en tiempo real in situ. Las técnicas de análisis químico que utilizan métodos cromatográficos y espectroscópicos son muy precisas y sensibles, pero también costosas, ya que requieren equipos de laboratorio complejos, personal cualificado y, con bastante frecuencia, pretratamiento de muestras antes de poder realizar las mediciones.
Los bioensayos son procedimientos mediante los cuales se estima el efecto potencial de una sustancia sobre la materia viva. Son importantes porque complementan los análisis químicos y responden a una pregunta simple que el análisis químico no puede: ¿la muestra es tóxica?

Estos bioensayos de toxicidad se llevan a cabo mediante pruebas estándar con organismos relevantes para el medio ambiente acuático, como microalgas o peces, siguiendo criterios de toxicidad (inhibición del crecimiento, inmovilización, tasa de alimentación, mortalidad o reproducción), así como marcadores bioquímicos (contenido de pigmentos y actividades enzimáticas).

Con los años, se han desarrollado bioensayos de toxicidad menos laboriosos,  más rápidos y rentables: los biosensores, que se definen como dispositivos que detectan, transmiten y registran información sobre un cambio fisiológico o bioquímico [1]. Estos dispositivos integran un elemento de reconocimiento biológico con un transductor físico para generar una señal medible, proporcional a la concentración de los tóxicos [2]

Los biosensores se pueden agrupar según su elemento biológico o su elemento de transducción. Entre los elementos de reconocimiento biológico, la utilización de células enteras tienen el beneficio de una estabilidad mejorada y menor coste en comparación con otros elementos biológicos y sobre todo, brindan información sobre la biodisponibilidad del contaminante [3]. El uso de bacterias, levaduras y microalgas resulta muy conveniente facilidad de cultivo, manipulación, conservación y la posibilidad de manipulación genética [4].

Dependiendo de su elemento de transducción, los biosensores se pueden dividir en biosensores ópticos, electroquímicos, termométricos, piezoeléctricos o magnéticos. Los ópticos son los biosensores más utilizados y su detección se basa en la interacción del campo óptico con un elemento de reconocimiento biológico. Los biosensores microbianos ópticos de células enteras responden a la presencia de químicos o tensiones fisiológicas a través de la síntesis de una proteína indicadora, como pueden ser la luciferasa, la β-galactosidasa, o proteína verde fluorescente. Por lo tanto, la proteína indicadora presenta una señal específica como señal detectable [5].

Además, se puede diferenciar los biosensores microbianos naturales, como aquellos que portan de forma natural su sistema reportero y los transgénicos, que han sido modificados genéticamente para portarlos, en este último caso se conocen también como cepas biorreporteras.

Estas cepas biorreporteras, en general, son células microbianas vivas intactas que han sido diseñadas genéticamente para producir una señal medible en respuesta a un agente químico o físico específico en su entorno.

La modificación genética consiste en la introducción de un sistema reportero fusionado a una secuencia promotora en el organismo a través de un vector genético. El gen reportero típicamente codifica una proteína reportera que finalmente genera una señal detectable. Existen dos tipos principales de cepas biorreporteras microbianas dependiendo de la respuesta ambiental del promotor seleccionado para su desarrollo: no específicos (Turn-off) y específicos (Turn-on) [4] (Figura 1).

Figura 1. Concepto de cepas biorreporteras Turn-off y Turn-on basadas en la cianobacteria Anabaena sp. A)  Las cepas Turn-off, detectan la toxicidad general como una disminución en la señal del gen reportero; el sistema reportero está fusionado con un promotor constitutivo y la toxicidad conduce a la inhibición de la señal. B) En las cepas Turn-on, el sistema reportero está fusionado a promotores de genes que responden a contaminantes / grupos de contaminantes específicos que son inducidos en respuesta a estos químicos. Tomada de Mateo y col. (2015) [6].

Hasta la fecha, los biosensores o cepas biorreporteras más utilizados en ecotoxicología están basados en microorganismos modelo como pueden ser Escherichia coli o Aliivibrio fischerii. Estos biosensores, aunque eficaces a la hora de detectar y/o cuantificar los contaminantes, carecen de relevancia ecológica en el medio ambiente acuático. Por ello, en los últimos años se han construido biosensores basados en microalgas, más concretamente en aquellas pertenecientes al grupo de las cianobacterias, cuyo papel como productores primarios, las hace organismos relevantes para evaluar la calidad del agua.

Las cianobacterias ya se han aplicado en el campo de la construcción de cepas biorreporteras para estudios de ecotoxicología, pero de manera marginal en comparación con otros microorganismos de menor relevancia ecológica [10].

Hasta la fecha, todas las cepas biorreporteras de cianobacterias construidas se basan en sistemas reporteros de luminiscencia y sólo se han construido para detectar:

  • Toxicidad general.  En la actualidad existen sólo dos cepas biorreporteras basadas en cianobacterias que detectan toxicidad general (Turn-off); es decir, en presencia de un contaminante o estrés que afecte a su metabolismo, disminuye su señal. Una de ellas basada en Synechocystis sp. PCC6803, y otra de ellas basada en Anabaena sp. PCC7120, que es autoluminiscente y ha sido testada con numerosos contaminantes emergentes y en diferentes matrices de aguas naturales [11].
  • Biodisponibilidad de nutrientes. Como productores primarios tanto en agua dulce como en ambientes marinos, la relevancia ambiental de las cianobacterias las convierte en una herramienta útil para evaluar la biodisponibilidad de nutrientes en los cuerpos de agua [6]. El hierro, el fosfato y el nitrógeno son esenciales para la producción primaria, además, un exceso de P y / o N puede conducir a la eutrofización de los cuerpos de agua, lo que puede conducir a la producción de toxinas por las cianobacterias [12]. Por ello varias cepas basadas en su mayoría en cepas de Synechococcus sp. y en Anabaena sp. han sido utilizadas para construir cepas biorreporteras capaces de evaluar la biodisponibilidad de nutrientes esenciales [6].
  • Metales pesados. La detección de metales pesados en el medio ambiente es ampliamente estudiada. En el caso de los estudios realizados con cepas biorreporteras, los resultados brindan información sobre la fracción que puede ejercer toxicidad para la biota en el medio ambiente. En estos organismos, la parte del sensor es el promotor de un gen sensible al metal fusionado a un sistema reportero y un gen que codifica un regulador transcripcional que cuando un metal está presente en la célula activa el promotor (Turn-on) [13]. las cepas más utilizadas para construir estos biosensores son Synechocystis sp. y Synechococcus sp. [14-16].
  • Estrés oxidativo. El estrés oxidativo, es decir, un aumento en las especies reactivas de oxígeno, es una de las respuestas primarias causadas por contaminantes en el medio ambiente [17]. Por ello, poder detectar dichas especies reactivas de oxígeno en el medio acuático es importante para poder evaluar así la toxicidad de uno o varios contaminantes presentes en un agua para los organismos que allí habitan. Hasta le fecha sólo se han construido cuatro cepas biorreporteras basadas en cianobacterias capaces de detectar especies reactivas de oxígeno basadas en Anabaena sp. [18, 19]. Estas cepas biorreporteras Turn-on son capaces de detectar diferentes especies reactivas de oxígeno producido por diferentes contaminantes y han sido testadas en matrices naturales.

Las cepas biorreporteras cianobacterianas ofrecen una alternativa de bajo costo y bajo mantenimiento a las cepas biorreporteras heterotróficas como Escherichia coli o Aliibrio fischeri. Debido a su papel en el ciclo de nutrientes y en la formación de floraciones de algas bajo condiciones eutróficas en depósitos de agua, la mayoría de las cepas biorreporteras de cianobacterias construidas hasta la fecha se han centrado en la detección de Fe, N y especies químicas de P. Sin embargo, con respecto a otras fuentes de contaminación, las cianobacterias han sido muy poco explotadas como cepas biorreporteras: solo se han construido dos cepas de cianobacterias para pruebas de ecotoxicidad general. Con respecto a contaminantes específicos, solo tres cepas biorreporteras han sido construidas para detectar metales pesados hasta la fecha y cuatro cepas capaces de detectar especies reactivas de oxígeno.

Queda mucho por hacer en la construcción de cepas biorreporteras basadas en cianobacterias, por ejemplo, deberían ser evaluados nuevos sistemas reporteros (la mayoría de ellos son bioluminiscentes) y también, dado que más de 100 genomas de cianobacterias han sido secuenciados en los últimos años, los nuevos elementos genéticos sensibles a los contaminantes podrían ser identificados y utilizados para construir, por ejemplo, nuevas cepas que detecten contaminantes específicos o daño genotóxico, que podrían útiles evaluando la calidad del agua.

Además, y como última puntualización, las cepas biorreporteras basadas en cianobacterias no han sido inmovilizadas con éxito hasta la fecha. Esta inmovilización supondría un gran avance para convertirlas en biosensores portables y de más fácil manejo fuera del laboratorio.

El grupo de investigación Bioe de la UAH, en el marco de la red REMTAVARES, desarrolla procesos biológicos de tratamiento de aguas residuales, y lleva a cabo test de toxicidad aplicando bioensayos típicos. Además, en la actualidad investiga en la construcción y desarrollo de biosensores basados en la δ-proteobacteria Geobacter sulfurreducens, presente tanto en suelos como en sedimentos anaerobios. Esta bacteria es capaz de producir electricidad de forma natural, lo que la convierte en un potencial biosensor para evaluar la calidad del agua, utilizando tanto los organismos per se (biosensores naturales) como cepas modificadas genéticamente que respondan ante la presencia de algún contaminante o estrés específico.

Referencias

1. Su, L., et al., Microbial biosensors: a review. Biosensors and bioelectronics, 2011. 26(5): p. 1788-1799.
2.  Belkin, S., Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants. Current opinion in microbiology, 2003. 6(3): p. 206-212.
3. Fernández-Piñas, F., et al., Evaluation of the ecotoxicity of pollutants with bioluminescent microorganisms, in Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology-Volume 2. 2014, Springer. p. 65-135.
4. Van Der Meer, J.R. and S. Belkin, Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology, 2010. 8(7): p. 511-522.
5. Yagi, K., Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science. Applied microbiology and biotechnology, 2007. 73(6): p. 1251-1258.
6. Mateo, P., et al., Cyanobacteria as bioindicators and bioreporters of environmental analysis in aquatic ecosystems. Biodiversity and conservation, 2015. 24(4): p. 909-948.
7. Flores, F.G., The cyanobacteria: molecular biology, genomics, and evolution. 2008: Horizon Scientific Press.
8. Garcia-Pichel, F., et al., Timing the evolutionary advent of cyanobacteria and the later Great Oxidation Event using gene phylogenies of a sunscreen. mBio, 2019. 10(3): p. e00561-19.
9. González-Pleiter, M., et al., Ecotoxicological assessment of antibiotics in freshwater using cyanobacteria, in Cyanobacteria. 2019, Elsevier. p. 399-417.
10. Bachmann, T., Transforming cyanobacteria into bioreporters of biological relevance. Trends in biotechnology, 2003. 21(6): p. 247-249.
11. Hurtado-Gallego, J., et al., Luminescent microbial bioassays and microalgal biosensors as tools for environmental toxicity evaluation. Handbook of Cell Biosensors; Thouand, G., Ed.; Springer International Publishing: Cham, Switzerland, 2019: p. 1-58.
12. Dodds, W.K. and E.B. Welch, Establishing nutrient criteria in streams. Journal of the North American Benthological Society, 2000. 19(1): p. 186-196.
13. Hynninen, A., K. Tõnismann, and M. Virta, Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered bugs, 2010. 1(2): p. 132-138.
14. Martin-Betancor, K., et al., Construction of a self-luminescent cyanobacterial bioreporter that detects a broad range of bioavailable heavy metals in aquatic environments. Frontiers in microbiology, 2015. 6: p. 186.
15. Erbe, J., et al., Cyanobacteria carrying ansmt-lux transcriptional fusion as biosensors for the detection of heavy metal cations. Journal of industrial microbiology, 1996. 17(2): p. 80-83.
16. Peca, L., et al., Construction of bioluminescent cyanobacterial reporter strains for detection of nickel, cobalt and zinc. FEMS microbiology letters, 2008. 289(2): p. 258-264.
17. Lushchak, V.I., Adaptive response to oxidative stress: Bacteria, fungi, plants and animals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2011. 153(2): p. 175-190.
18. Hurtado-Gallego, J., et al., Two novel cyanobacterial bioluminescent whole-cell bioreporters based on superoxide dismutases MnSod and FeSod to detect superoxide anion. Chemosphere, 2018. 201: p. 772-779.
19. Hurtado-Gallego, J., et al., Peroxiredoxin (2-cys-prx) and catalase (katA) cyanobacterial-based bioluminescent bioreporters to detect oxidative stress in the aquatic environment. Chemosphere, 2019. 236: p. 124395.

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