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12/12/2011  
A la búsqueda de nanosistemas inteligentes y biocompatibles

El biólogo y el ingeniero no dejan de pensar en productos acabados −aunque por optimizar− e integrados en el interior de otros sistemas porque eso es lo que observan en el interior de las células, por un lado, y en la tecnología existente por el otro: maquinarias que desarrollan labores especializadas, coordinadas y precisas, y que de otro modo dejarían de existir en la línea evolutiva. Los primeros productos de la ingeniería en la nanoescala que puedan integrarse en sistemas biológicos están empezando a aparecer en el mercado de la naturaleza: las nanopartículas. Son los principios de una ingeniería que intenta asaltar el mito de la vida desde sus componentes más pequeños. Pero el mercado de la naturaleza..., es muy exigente, con millones de años de tradición.


AUTOR | J. Ricardo Arias González, Silvia Hormeño y Beatriz H. Juárez. Fundación IMDEA Nanociencia y Universidad Autónoma de Madrid.



Estimular la imaginación es un placer evolutivamente sofisticado en el ser humano. Recientemente, la Nanotecnología ha empezado a estimularla hasta tal punto que es muy difícil hoy distinguir cuántos de los montajes mentales, sean de científicos o de directores de cine, pueden descartarse por un simple criterio de falsabilidad, como el que Popper propuso para juzgar la rectitud de la labor filosófica. Los estímulos, sin embargo, no excitan nuestra mente sino a través de nuestros sentidos, y los sentidos no son otra cosa que sensores químico-físicos que habitan nuestro cuerpo. Esos sensores naturales están integrados en un hardware (nuestros órganos) con un diseño que en dos aspectos fundamentales están hoy muy lejos de nuestra tecnología: la complejidad y la escala de tamaño. La complejidad es un término que emplean los científicos para referirse, en pocas palabras, a la alta coordinación y precisión con la que algo funciona; y la ventana de tamaño, el nanómetro, es tan diminuta que apenas nos empezamos a asomar ahora. ¿Podemos soñar con imitar la naturaleza? Quizás no sea la pregunta más práctica, al igual que ‘podremos’ quizás no sea la respuesta más válida.

Un sistema inteligente

¿Podemos diseñar algo complejo y preciso en escalas de nanómetros? ¿Podemos observarlo y manipularlo mientras funciona? Éstas parecen ser las preguntas que al menos el equipo interdisciplinar liderado por Beatriz H. Juárez, Silvia Hormeño y Ricardo Arias se hicieron cuando pensaron en el diseño de partículas muy pequeñas sensibles a estímulos de luz altamente selectivos [1]. ¿Podemos hacerlo en solución acuosa o en medios bio-compatibles? Una respuesta positiva a esta pregunta permitiría especular sobre el uso de sistemas inteligentes nanométricos como herramienta de investigación en células.

Este equipo usó confinadores de luz, llamados nanocristales semiconductores o puntos cuánticos [2], y conversores de luz en calor como son las nanopartículas de oro, para que se comunicasen en distancias de unos pocos nanómetros sobre plataformas submicrométricas esféricas que cambian de tamaño en función de la temperatura. Lo que han diseñado permite detectar radiación electromagnética de una determinada longitud de onda y traducirla en una respuesta mecánica. Específicamente, si la radiación electromagnética estimuladora incide en las plataformas, éstas se contraen como esponjas que se secan. El proceso se detecta porque durante el mismo se emite luz de una longitud de onda diferente a la inicial. Para ello, los puntos cuánticos químicamente depositados sobre las plataformas termo-contráctiles atrapan la radiación inicial y la re-emiten a esta segunda longitud de onda. A su vez, las partículas de oro actúan como nano-estufas: emiten calor localmente, imperceptible para nosotros pero perceptible para las plataformas sobre las que residen. Tan perceptible para estas plataformas, que la pequeña cantidad de calor liberada las contrae mediante lo que se conoce como una transición de fase. Este proceso se activa al instante, en nanosegundos, lo cual es importante si queremos construir dispositivos de rápida respuesta. La contracción se traduce en un acercamiento entre los puntos cuánticos y las nanopartículas metálicas hasta alcanzar las distancias requeridas para la comunicación entre ellas. A esta comunicación se la conoce como interacción excitón-plasmón.

Diferentes tipos de partículas usadas
Figura 1. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de (a), nanocristales semiconductores y (b), nanopartículas metálicas. (c) Imagen de microscopía electrónica de una plataforma individual, con las nanopartículas de oro (puntos negros) y los puntos cuánticos coloidales (fondo granulado de color gris) sobre su superficie


El diseño

La figura 1 muestra los diferentes tipos de partículas usadas. Estas imágenes están realizadas por microscopía electrónica de transmisión, una técnica experimental que en vez de usar luz para fotografiar objetos, utiliza electrones −que hacen las veces de fotones−. Los objetos con tamaños inferiores a un micrómetro no pueden resolverse con técnicas ópticas porque los fotones en el visible no tienen la suficiente energía como para penetrar en los detalles de los objetos de esas dimensiones, y por ello se acude al uso de haces de electrones. La figura 1(a) muestra una dispersión de puntos cuánticos y la figura 1(b) una dispersión de nanopartículas de oro. Ambos tipos de partícula aparecen como puntos negros que corresponden a tamaños nanométricos (1 nanómetro equivale a una millonésima parte de un milímetro). La figura 1(c) muestra una plataforma de unos 800 nm de diámetro recubierta de ambos tipos de partículas. La plataforma, aproximadamente esférica, está sintetizada a partir de agua y de un polímero conocido como pNIPAM.

Como se puede apreciar en dicha imagen 1(c), la plataforma termocontráctil está recubierta por puntos cuánticos y nanopartículas de oro. La plataforma sirve como sitio de anclaje de los dos tipos de nanopartículas de manera que éstas permanecerán separadas por distancias de nanómetros, distancias que serán críticas para que se produzcan la comunicación entre ellas. A su vez, la plataforma esférica no es pasiva sino que se contrae conforme sube la temperatura en su seno expulsando así agua de su interior. Estos cambios de temperatura vendrán causados por la liberación de calor desde las partículas de oro, como se explica a continuación.

La estrategia tecnológica: cómo medir en un sistema tan pequeño

Si el diseño de algo inteligente y pequeño es ya una tarea compleja, no lo es menos el poder caracterizarlo. No lo es menos porque manipular y medir algo que ocurre en distancias de unos pocos nanómetros es una cuestión tecnológica que sólo habitaba hasta hace poco los en los guiones cinematográficos. La naturaleza diseña sistemas pequeños pero no necesita caracterizarlos: sólo si funcionan en el entorno que habitan, permanecerán vivos. Pero nosotros, los seres humanos, sí necesitamos medirlos para comprenderlos y demostrar su viabilidad antes de sacarlo a nuestro ecosistema artificial. En ese sentido, este equipo, del Instituto Madrileño de Estudios Avanzados en Nanociencia (IMDEA Nanociencia) y con participación en el Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, y las universidades Autónoma de Madrid y de Hamburgo, tuvo que poder atrapar y controlar con precisión y de manera individual las plataformas antes descritas.

Para entender la aproximación experimental, comencemos con un ejemplo muy sencillo. Si tenemos que coger un objeto muy pequeño y delicado, instintivamente el ser humano juntaría su pulgar con su índice para atraparlo. En una escala tan precisa o más que el propio ser humano la robótica ha desarrollado manipuladores de objetos de tamaños muy diversos siguiendo esta estrategia, y basándose en efectos físicos como la piezoelectricidad. La óptica también ha contribuido al desarrollo de sistemas de manipulación que en vez de utilizar contacto mecánico, utilizan luz láser altamente concentrada, para atrapar a la manera de guante de béisbol [3]. A esta técnica se la conoce como pinzas ópticas, y permite entre otras cosas, jugar con objetos extremadamente delicados y pequeños como son el ADN y las proteínas, o las células y sus componentes interiores.

Representación del experimento
Figura 2. Representación del experimento: plataformas esféricas del material termo-contráctil, son atrapadas y estimuladas por luz láser infrarroja altamente concentrada (pinza óptica). La plataforma puede estar recubierta con nanopartículas metálicas, cristales semiconductores o una combinación de ambos


Estos científicos adoptaron esta estrategia para manipular las plataformas termo-contráctiles, como se desprende de la representación pictórica de la figura 2. El experimento transcurre como se muestra en dicha figura: una plataforma termocontráctil como las de la figura 1(c) se fluye en agua y se atrapa por medio de láser. La partícula libre está sometida a los choques de las moléculas de agua de manera que describe una trayectoria aleatoria en el fluido hasta que es agarrada por la pinza óptica. Entender el principio de atrapamiento de partículas por medio de un láser altamente focalizado implica entender el comportamiento de la materia ante la radiación electromagnética. Este tema que no es importante para entender el nanosistema de estudio se analiza más en profundidad en [3].

Las pinzas ópticas usadas por este equipo fueron desarrolladas por dos de sus componentes en el Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, en el año 2005, y se utilizan hoy en IMDEA Nanociencia para entender el comportamiento de la maquinaria celular (proteínas y orgánulos) y las propiedades elásticas de los ácidos nucleicos. Para el estudio de sistemas biocompatibles como el que se describe aquí, este equipo adoptó la estrategia experimental no sólo para manipular las plataformas una a una, como se muestra en la figura 2, sino también para usar el propio láser de atrapamiento como fuente de estimulación de las nanopartículas.

La caracterización

La manipulación individual de las plataformas permite medir sus cambios de tamaño y ésta es la medida experimental clave para la caracterización indirecta de los procesos físicos que ocurren en su superficie. Para medir los cambios de tamaño, la luz que atraviesa la plataforma atrapada es redirigida a fotodetectores sensibles a la posición. El patrón de luz dispersada recogido por estos fotodetectores es analizado por métodos estadísticos que tienen en cuenta las fluctuaciones en la posición de la plataforma termocontráctil en la pinza óptica [4].

Las plataformas termocontráctiles tienen un diámetro de unos 800 nm (ver figura 1c). Cuando las plataformas desnudas (sin ningún tipo de nanopartículas en su superficie) se atrapan en el sistema de pinzas ópticas, las medidas arrojan un diámetro de unos 600 nm (Figura 3a), lo cual refleja un moderado calentamiento del sistema por estar sometido a la influencia del láser. Es conocido que la radiación infrarroja, que es la que emite el láser de atrapamiento, es absorbida por el agua. Teniendo en cuenta que las plataformas termocontráctiles contienen agua, el efecto de la iluminación con el láser de atrapamiento es también el calentamiento de la misma y la expulsión de moléculas de agua, dando lugar así a una reducción de tamaño. Conforme la plataforma absorbe más energía en forma de calor, ésta se contrae más.

Tamaños aproximados de las plataformas termocontráctiles
Figura 3. Tamaños aproximados de las plataformas termocontráctiles en ausencia de recubrimiento, (a), y en función del recubrimiento con nanopartículas metálicas, (b), semiconductoras, (c), y con ambos tipos, (d)


Cuando las plataformas se recubren con nanopartículas de oro, la reducción de tamaño es más acusada, como se describe en la figura 3(b). La razón de esto es que los metales −en este caso, el oro− absorben fuertemente la energía lumínica que penetra en su interior y la transforman en calor. Este proceso de transformación de energía se debe a que la radiación electromagnética del láser hace oscilar los electrones del metal y estos, por fricción, transforman su energía cinética en calor. En definitiva, las nanopartículas de oro sobre la superficie de las plataformas actúan como potentes conversores de energía lumínica en calor. Además de eso, la red de nanopartículas potencia un mecanismo parecido al del efecto invernadero: bloquea la salida del calor que se emite hacia el interior de la plataforma y lo confina en su seno. El efecto de las nanopartículas de oro es entonces el de reforzar el proceso de contracción de las plataformas.

Cuando las plataformas se recubren por puntos cuánticos, el efecto es el contrario. Los nanocristales semiconductores sintetizados para este sistema confinan la luz del infrarrojo en su interior pero en vez de liberarla en forma de calor, la liberan de nuevo en forma de luz, esta vez de una longitud de onda que está en el naranja. Este proceso se conoce como generación de un excitón en el nanocristal semiconductor. El efecto es que a las plataformas les llega ahora muy poca radiación infrarroja de manera que apenas se contraen; su tamaño es similar al de las plataformas desnudas en ausencia de luz infrarroja (de unos 800 nm). Es importante destacar que los nanocristales semiconductores han sido químicamente sintetizados para sintonizar exactamente con la radiación infrarroja de atrapamiento, y que pueden también ajustarse en la síntesis para re-emitirla a la longitud de onda que se elija [2].

El cuarto caso caracterizado es cuando las plataformas están recubiertas por nanopartículas de oro y puntos cuánticos a la vez, figura 3(d). Este caso es el más interesante porque aquí ambos tipos de partículas se ponen en comunicación. Específicamente, la luz que llega desde el láser y que es absorbida por los puntos cuánticos se re-emite, como se ha explicado anteriormente, a otra longitud de onda en el naraja. Esta segunda longitud de onda se absorbe más fuertemente por las nanopartículas de oro que la radiación infrarroja directa del láser. Se absorbe más fuertemente porque la oscilación de los electrones en el interior de oro ahora es cooperativa: los electrones oscilan todos al mismo tiempo y en fase con la radiación electromagnética proveniente de los puntos cuánticos. Esta oscilación en fase se conoce como excitación de un plasmón superficial de la nanopartícula y, de nuevo, libera calor por la fricción de los electrones en el metal. El calor induce la contracción y consecuentemente un acercamiento entre los puntos cuánticos y las nanopartículas metálicas hasta alcanzar las distancias requeridas para la comunicación entre ellas.

El proceso de intercambio de energía entre la nanopartícula de oro y el punto cuántico se conoce entonces como interacción plasmón-excitón y se traduce, en este caso en un apagado paulatino de la luz, como se muestra en la figura 4. El tamaño medido de la plataforma termocontráctil es ahora de unos 400 nm, figura 3(d), inferior al caso de la plataforma desnuda, por el calentamiento generado en la excitación de plasmones, pero superior al caso de sólo nanopartículas de oro por la reconversión de parte de la radiación infrarroja incidente en la generación de excitones en los puntos cuánticos.

La selectividad en las longitudes de onda de reconocimiento y de comunicación entre los puntos cuánticos y las nanopartículas de oro es tan alta, a la vez que sintonizable, que convierte al sistema compuesto en un material inteligente: el mecanismo de contracción y detección no se activa si la señal lumínica externa no es la correcta. Para ello, el diseño de los puntos cuánticos y nanopartículas metálicas (definidos por un material, un tamaño y una geometría) están ajustados sutilmente por métodos químicos.

Representación del efecto de la pinza óptica sobre una esfera con nanocristales semiconductores y nanopartículas metálicas
Figura 4. (a) Representación del efecto de la pinza óptica sobre una esfera con nanocristales semiconductores y nanopartículas metálicas. (b) Bajo la radiación láser los nanocristales semiconductores emiten luz naranja y las nanopartículas metálicas calientan la plataforma termocontráctil, que se encoge, disminuyendo la distancia entre ambos tipos de nanopartículas. (c) Al alcanzar una determinada temperatura, la distancia entre las nanopartículas es tan pequeña que los cristales semiconductores se apagan. (d) Fotogramas en blanco y negro del proceso en el que se observa la disminución gradual de la emisión de luz naranja (punto blanco en las imágenes) de los nanocristales semiconductores en la trampa óptica


Las aplicaciones

¿Qué radiación es la deseada o nociva para nosotros o para algún otro aparato en el que necesitemos integrar sistemas de vigilancia? Puede que haya muy poco espacio para almacenar sensores con respuesta precisa y rápida. El sistema diseñado por este equipo sugiere una estrategia para satisfacer este tipo de requerimientos. ¿Podemos integrar en chips de diagnóstico, como los que ya existen para test individuales de glucosa en sangre, sensores de radiación perniciosa? ¿Podemos integrarlos en nuestras células? Las variaciones de tamaños de las plataformas nos permiten conocer indirectamente su temperatura aproximada. A la vez, las pinzas ópticas nos permiten mantener una plataforma en una posición determinada o dirigirla a un objetivo. En particular, pueden manipularse dentro de un fluido que reproduzca un escenario biológico o enviarse contra células para estudiar procesos de internalización o de manipulación intracelular.

Este equipo redirige parte de sus esfuerzos investigadores en el presente a atacar estas cuestiones. Internalizar partículas en células puede ser relativamente sencillo desde un punto de vista mecánico puesto que la membrana celular no es rígida. La membrana celular es, de hecho, una superficie activa que regula el intercambio de multitud bioelementos como iones y macromoléculas. El problema principal es que la célula 'sabe' demasiado: es capaz de distinguir lo que necesita de lo que no hasta el punto de suicidarse si se le fuerza a aceptar elementos extraños en su interior. Intentar introducir partículas tan extrañas como el nanosistema aquí contado es entonces −y digámoslo así− jugar a engañar a la célula. Las nanopartículas de oro son inorgánicas y los puntos cuánticos, además, son tóxicos para la célula. Todo esto descarta la utilidad de este nanosistema con fines terapéuticos en seres humanos. Sin embargo, puede ser útil en diagnosis con muestras externas y puede representar una herramienta interesante para la investigación en células si se les recubre adecuadamente.

Tanto los puntos cuánticos como las nanopartículas de oro se han recubierto de polímeros biocompatibles. A su vez, el sistema conjunto puede recubrirse de otra sustancia de manera que la célula se confunda y lo reconozca como un bioelemento. La internalización forzada físicamente puede ser una estrategia útil aprovechando el hecho de que las partículas de oro liberan calor de manera que pueden usarse para fundir localmente la membrana celular. Una vez dentro, los puntos cuánticos servirían como bombillas muy pequeñas que permitirían monitorizar la posición del sistema en su viaje por el interior de la célula. El guiado de nanopartículas en el interior será entonces otro reto ambicioso.


Agradecimientos:
Los autores agradecen la colaboración científica con Neus G. Bastús, Andrea Pietsch y Horst Weller en la Universidad de Hamburgo, Alemania. También, agradecen a Christian Klinke la representación artística de la figura 2. Igualmente agradecen a la Comisión Europea, el Ministerio de Ciencia e Innovación y la Comunidad de Madrid por la financiación obtenida a través de los proyectos ERG FP7-PEOPLE-ERG-2008, RYC-2007-01709, RYC-2007-01765, MAT 2009-13488 y NANOBIOMAGNET S2009-MAT-1726.



Referencias:
[1] Plasmon-Exciton Interactions on Single Thermoresponsive Platforms Demonstrated by Optical Tweezers, S. Hormeño, N.G. Bastús, A. Pietsch, H. Weller, J.R. Arias-González y B.H. Juárez, Nano Letters 11, 4742-4747, 2011.
[2] Nanopartículas semiconductoras coloidales y aplicaciones, B. H. Juárez, Anales de Química. 107(3), 229-236. 2011
[3] Manipulación láser de células, orgánulos y biomoléculas, J.R. Arias-González, Revista Española de Física 24, 46-52, 2010.
[4] Biofísica de centrosomas y ADN mediante manipulación óptica, S. Hormeño, Tesis doctoral, Universidad Autónoma de Madrid, 2010.


   Enlaces de interés
- IMDEA Nanociencia



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