INMUNOLOGIA Y GENETICA APLICADA S.A., INGENASA, fue creada en 1981 como una empresa dedicada a las aplicaciones industriales de la biotecnología. Sus objetivos son investigar, desarrollar y comercializar productos para el diagnóstico y prevención de enfermedades infecciosas de especial relevancia económica en las áreas deSanidad Animal y Protección Vegetal. La combinación de equipos multidisciplinarios en Inmunología, Genética y Biología Molecular consigue una mejor integración y resolución de los problemas, aplicando técnicas de anticuerpos monoclonales, clonaje y expresión de proteínas en microorganismos recombinantes, PCR, etc. La empresa ofrece, además, un servicio externo de diagnóstico.

Tras varios años de esfuerzo en investigación y gracias a la fructífera colaboración con instituciones públicas y privadas nacionales e internacionales, INGENASA ha desarrollado procedimientos de diagnóstico y agentes terapéuticos para varias enfermedades, entre ellas algunas de las que causan mayores pérdidas económicas en el sector ganadero. Entre estas últimas se encuentra la arteritis viral equina (AVE), en la que INGENASA está actualmente trabajando gracias a un proyecto subvencionado por la Dirección General de Investigación de la Comunidad de Madrid, quien desde hace años colabora con nosotros de manera eficaz y continuada. La finalidad de este proyecto es la obtención de un ensayo diagnóstico basado en proteínas y anticuerpos recombinantes producidos en E. coli o baculovirus que mantengan y mejoren la sensibilidad y especificidad de los actuales ensayos y aumente su nivel de estandarización y robustez.

El Virus de la Arteritis Equina (VAE) es un miembro del género Arterivirus, perteneciente a la familia Arteriviridae. Presenta como genoma un ARN de cadena sencilla y polaridad positiva protegido por una nucleocápsida y una envuelta lipoproteíca (fig 1). La AVE afecta a équidos de todas las edades y puede resultar en el desarrollo de síntomas o en una infección inaparente, dependiendo de la cepa viral. Cuando hay infección visible, los síntomas pueden variar en rango y severidad. Los típicos casos de AVE presentan, entre otros, los siguientes síntomas: fiebre, leucopenia, anorexia y depresión; descargas oculares y nasales, edemas y abortos en yeguas que pueden ser tanto en estadios tempranos como tardíos de la gestación. La AVE ha adquirido recientemente una gran importancia por la exigencia de certificados que aseguren que los animales no son portadores, hasta el punto de prever la puesta en marcha de un plan de control de la enfermedad.

INGENASA dispone en la actualidad del único ELISA en el mercado para la detección de anticuerpos específicos del virus de la arteritis equina. Es un ELISA de tipo indirecto, en el que los anticuerpos presentes en los sueros de caballos infectados se unen al virus purificado adsorbido en el pocillo; para detectar su presencia se añade un anticuerpo monoclonal específico de IgG de caballo marcado con la enzima peroxidasa y posteriormente, el sustrato apropiado que reacciona con estaenzima (fig2).Con esta reacción colorimétrica se detecta la presencia de anticuerpos frente a VAE y, por lo tanto, de infección. El ensayo, aunque eficaz por su correlación con la técnica de referencia (seroneutralización) tiene como factor limitante el alto coste de producción del antígeno viral.

El objetivo del proyecto se abordó desde dos frentes:

1. Se clonaron y expresaron las principales proteínas virales (fig1) en el sistema de E. coli o de baculovirus para intentar sustituir el antígeno viral por las proteínas recombinantes.
2. Se construyó mediante PCR un anticuerpo recombinante de cadena sencilla (scFv) para utilizarlo en lugar del actual anticuerpo monoclonal anti IgG de caballo.

A partir de un aislado del virus se amplificaron mediante la técnica RT-PCR las secuencias que codifican para las proteínas más inmunogénicas del EAV: la glicoproteína GL,la proteína N y la M (fig1). Las tres fueron clonadas para expresarlas en la bacteria E. coli. Además, dos secuencias pertenecientes a la parte externa o ectodominiode la glicoproteína GL, una de las zonas más inmunogénicas del virus,se clonaron y expresaron en células de insecto.

Para la construcción del anticuerpo monoclonal recombinante de cadena sencilla (scFv) frente a IgG de caballo se partió de células de hibridoma secretoras de anticuerpos anti-IgG de caballo. Se extrajo el ARN total de las células y, mediante la técnica de RT-PCR , se obtuvieron por separado las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo (VH y VL, respectivamente). Posteriormente, se modificaron ambas regiones mediante sendas PCRs de tal forma que se añadió una secuencia de reconocimiento de la proteína extreptavidina (que permitirá detectar la presencia del anticuerpo). Finalmente se unieron las dos cadenas, VH y VL,a través de un péptido de enlace en una última PCR dando lugar al scFv (fig 3)

La proteína del Ectodominio se ha probado en ensayos de ELISA y los resultados preliminares con sueros de caballo indican que puede ser apta para sustituir al virus de EAV como antígeno en los ensayos de diagnóstico. Actualmente se está trabajando en la mejora de la purificación de la proteína y de las condiciones del ELISA para obtener resultados óptimos.

El scFv fue construido, clonado y secuenciado para comprobar que la secuencia era correcta. Se ha expresado como una proteína de fusión en el citoplasma de la bacteria E. coli y se ha detectado por inmunobloting. No obstante, existen ciertas dificultades a la hora de obtener cantidades adecuadas de proteína por lo que se está estudiando la manera de obtener un mejor rendimiento. Asimismo, se está evaluando la capacidad del anticuerpo recombinante para reconocer a las IgGs de caballo presentes en los sueros de animales infectados con AVE, y por otro lado, su capacidad para poder ser detectado él mismo en el ensayo de ELISA.

Hasta el momento, hemos obtenido las bases para desarrollar un ensayo diagnóstico de AVE que sea capaz de mejorar el que está en uso actualmente. Será necesario establecer cuáles son las mejores condiciones de utilización de las proteínas recombinantes para que la combinación de los productos expresados permita la conformación de un ensayo de diagnóstico sensible y específico para el virus de la Arteritis equina, que resuelva los problemas de bajo rendimiento en la producción de antígeno e inespecificidades debidas reacciones cruzadas de algunos sueros de caballo. Además, la sustitución del actual anticuerpo monoclonal evitaría el uso de animales de experimentación.