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	Enfermedad Celiaca y Gluten en el nuevo milenio I
	Dr. Enrique Méndez Centro Nacional de Biotecnología Cantoblanco, 28049 Madrid. tef 91-585 4842 fax 91 585 4506 e-mail emendez @cnb.uam.es
	La enfermedad celiaca (EC) es una intolerancia permanente al gluten (fracción de prolaminas del trigo) y más especificamente a su fraccion proteica la gliadina, así como a las proteinas análogas del centeno (o secalina), de la cebada (hordeina) y de la avena (avenina). La ingesta de dichas proteinas induce, en personas genéticamente predispuestas, una lesión severa de la mucosa intestinal, que se caracteriza histologicamente por una hiperplasia de criptas con atrofia total o subtotal de las vellosidades intestinales. La EC tiene una incidencia aproximada de 1:300 habitantes, aunque existen diferencias geográficas importantes (1:100-1:5000) que no siempre pueden adscribirse a diferencias genéticas o ambientales. Estas diferencias parecen reducirse en gran medida cuando se aplican políticas activas de despistaje de la enfermedad, actitud que ha tomado gran relevancia en los últimos años debido a un mejor conocimiento del amplio espectro clínico de la enfermedad y gracias a la disponibilidad de marcadores serológicos que permiten establecer una sospecha diagnostica aún en pacientes mono o asintomaticos. Se ha establecido una fuerte asociación entre el sistema mayor de histocompatibilidad (HLA) localizado en el cromosoma 6, y muy especialmente con el antigeno DQ2,.que es una molécula heterodímera formada por dos cadenas (alfa y beta), codificadas por las alelos HLA DQA* 0501 y HLA DQB* 0201 respectivamente. El DQ2 se encuentra en 90-95% de enfermos celiacos y en 20-30% de controles sanos europeos. Se describe asimismo asociación con DQ8 (A1* 301/B1* 0302). Sin embargo no todos los enfermos celiacos comparten los alelos de riesgo y todos los individuos portadores de dichos alelos no desarrollan una EC. Debe existir por ellos otro gen de susceptibilidad implicado, no identificado por el momento. No se conoce con exactitud el mecanismo por el cual el gluten produce la lesión intestinal, aunque en el momento actual se propugna la Teoría Inmunológica., según la cual estos pacientes presentan una respuesta inmunológica desencadenada por la ingesta de gluten cuyo resultado final es la destrucción de la mucosa intestinal y secundariamente una alteracion de la función absortiva. Sin embargo, no todas las manifestaciones clinicas y/o biologicas de los individuos celiacos son justificables por un síndrome de mal absorción de macro o micronutrientes. Junto a las *formas clinicas clásicas* de presentación, en el niño entre el 1er-3er año de vida y en el adulto en la 3ª y 4ª década, con predominio en ambos casos de sintomatología digestiva y afectación nutricional , existen formas de menor expresividad clínica: son las formas pauci o monosintomaticas, también denominadas atípicas, cuya frecuencia en algunos países como Finlandia sobrepasan incluso la frecuencia de las formas clásicas. EC SINTOMATICA * CLASICA O TIPICA. - EDAD PEDIATRICA: CLINICA NUTRICIONAL + DIGESTIVA - ADULTOS: CLINICA DIGESTIVA (+NUTRICIONAL) MONOSINTOMATICA O ATIPICA - TALLA BAJA - INFERTILIDAD / ABORTOS - RETRASO PUBERTAD - MANIFESTACIONES ARTICULARES - ANEMIA REFRACTARIA Tto - OSTEOPOROSIS. - HIPERTRANSAMINASEMIA - EPIILEPSIA REFRACTARIA AL Tto En la edad pediátrica la forma atípica más frecuente es la talla baja sin manifestaciones digestivas; También se han descrito retrasos en la pubertad, que en la edad adulta, especialmente en la mujer, tendrían su equivalente en infertilidad, o abortos de repetición, alteraciones del metabolismo calcio/fósforo con osteopenia y osteoporosis y manifestaciones articulares. Recientemente se han descrito pacientes con hipertransaminasemia, especialmente adultos, con hallazgos histológicos inespecificos. También se ha observado en los últimos años, casos esporádicos de epilepsias refractarias al tratamiento anticomicial, con presencia de calcificaciones intracraneales y respuesta clínica favorable a la exclusión del gluten de la dieta. Odontólogos escandinavos fueron los primeros en detectar alteraciones del esmalte dental en pacientes celiacos no diagnosticados (no tratados). Además de estas formas clínicas sintomáticas, aunque de expresividad clínica variable, en los últimos 10 años la disponibilidad de marcadores inmunológicos de EC ha puesto en evidencia la existencia de una serie de formas ocultas de EC que ha dado lugar a la representación gráfica propuesta por LOGAN en 1991, o Iceberg de la EC. Las formas sintomáticas (tanto típicas como atípicas) serían solo la parte visible del Iceberg, y aparecen unos conceptos o definiciones nuevas que son la EC silente, EC latente, EC potencial* . El termino de *EC silente* se aplica a aquellos casos o individuos sin manifestaciones clínicas que sin embargo presentan una lesión vellositaria característica de EC. El motivo que ha indicado la BI es generalmente la presencia de uno o varios marcadores de EC positivos. Este tipo de paciente fue detectado inicialmente en los grupos de familiares en primer grado de enfermos celiacos en los que, por la connotación genética de la enfermedad, se realizaba una vigilancia clínica mediante el estudio de marcadores. Por ello, *“la frecuencia de formas silentes de la enfermedad depende en gran medida de la atención con que se escuche.”* La evidencia de que ciertas enfermedades fundamentalmente de base autoinmune se asocian con mayor frecuencia a EC, ha motivado la utilización de marcadores serologicos como métodos de screening en estos grupos, observándose una proporción importante de casos silentes en enfermos Diabéticos Insulinodependientes o en pacientes con síndrome de Down. También se ha puesto en evidencia en los últimos años una situación clínica especial que se ha denominado *Enfermedad Celiaca Latente. Engloba aquellos individuos que llevando una dieta con gluten presentan una biopsia intestinal normal, pero que en otro momento, anterior o posterior han presentado una atrofia subtotal de vellosidades (ASV) con las características histológicas propias de la EC. Esta observación implica que una Biopsia Intestinal normal en un sujeto que está consumiendo gluten no excluye de forma definitiva* el diagnostico de EC. Existen otros grupos de pacientes, que presentan una BI sin alteraciones histológicas, en las que sin embargo se detecta otras alteraciones, principalmente inmunológicas, características de los pacientes celiacos, como son: un marcador, anticuerpos antiendomisio, positivo, aumento de Linfocitos Intraepiteliales y especialmente de la población que expresa marcadores d, o un patrón de Ac antigliadina a nivel de la mucosa de intestino delgado característico de EC. Para estos pacientes se propone el termino de *Enfermendad Celiaca Potencial; en ningún momento han presentado una lesión vellositaria característica, pero presentan unas alteracciones inmunológicas muy peculiares. Se especula que son individuos que potencialmente puede desarrollar una EC, probablemente relacionados con factores ambientales no conocidos. Es uno de los campos de investigación más novedoso e interesante en la actualidad. Además de estas formas ocultas silente, latente y potencial, existe otro tipo de pacientes que escapan a esta clasificación o definición, por lo que actualmente el termino que mejor incluye este amplío espectro clínico es el de CONDICION CELIACA.* Diagnostico de la Enfermedad Celiaca La descripción y observación de todas estas formas clínicas nuevas está en relación con el desarrollo de los *marcadores serologícos* o Anticuerpos circulantes en pacientes con EC y dirigidos frente a distintos antigenos. Los primeros en ser utilizados fueron los Anticuerpos Antigladina (AAG); Se determinan mediante técnicas de ELISA que son tecnicamente fáciles, reproducibles y baratas. Los Ac de clase IgM determinados sueros sonde escasa utilidad por su baja sensibilidad y especificidad. Los de clase IgG son sensibles,pero muy poco específicos, con un alto porcentajes (30-50 %) de falsos positivos. Los Ac de *clase IgA* son muy sensibles (superior al 90%) con una especificidad variable según la población a la que se aplique; puede ser superior al 85-90% en pacientes con patología digestiva. Sin embargo existe una gran discrepancia de resultados entre distintos autores, debida fundamentalmente a la diversidad de métodos utilizados. Los anticuerpos *antiendomisio , AAE,* se detectan en la muscularis mucosa del esófago de mono y más recientemente se está investigado la utilización de otros substratos, como cordón umbilical humano, con objeto de abaratar la técnica .En estos Ac tisulares la experiencia y valoración de los Ac de clase IgG está todavía por definir; los de clase IgA se relacionan más estrechamente con el daño de la mucosa, en los pacientes celiacos, que los AGA. La sensibilidad y especificidad que la EMA es superior al 90%; la especificidad cuando es discretamente inferior en adultos que en niños.Su sensibilidad varía según los grupos de población y la edad, siendo menos sensibles que los AGA en niños menores de 2 años y en los adolescentes y similar a los AGA en los otros grupos de edad. Recientemente Dieterich y col. han demostrado que la Transglutaminasa tisular (TGt) seria el principal y probablemente único antigeno de la enfermedad celiaca, que seria reconocido tanto por *anticuerpos antitransglutaminasa* como por los AAE. Troncone y cols encuentran para Ig anti –tTG una sensibilidad del 23% con una especificidad del 98%, con un valor predictivo positivo del 92% y negativo del 63%. Sin embargo, para el IgA anti-tTG la especificidad es del 98% con una sensibilidad del 92%, un valor predictivo positivo del 98% y negativo del 94%. La concordancia del IgA anti-tTG con el EMA es del 95%. Otros estudios realizados describen una sensibilidad del 100% con una especificidad entre el 95 al 98%, y una sensibilidad del 94% con una especificidad del 90%. Aunque no existen muchos trabajos hasta la actualidad, todos estos resultados basados en los tejidos transglutaminasa suponen una excelente relación coste-eficacia para el diagnóstico y screening de la Enfermedad Celiaca, obviándose el uso del substrato de una especie en peligro de extinción y la subjetividad de la inmunofluorescencia de los EMA, mejorando la especificidad de los AAG y asociando la metodología de los AAG (menor coste y más sencilla) con la alta eficacia diagnóstica de los EMA. Por todo ello si todos estos datos se confirman en estudios más amplios los anti-tTG parecen estar destinados a ser el marcador del futuro de la Enfermedad Celiaca. En el momento actual, *el diagnostico* debe basarse en el hallazgo de unas alteraciones características de la mucosa intestinal: Atrofia vellositaria severa, con inversión del cociente vellosidad/ cripta (hiperplasia de cripta) + Aumento de LIE. Ello implica necesariamente realización de al menos una biopsia intestinal, preferentemente una capsula de Crosby, por la mayor idoneidad de las muestras obtenidas (en comparación con las muestra con pinzas de endoscopia). La importante aportación al diagnostico de los marcadores serologicos estriba en su capacidad para el despistaje de las formas silentes o atipicas, siendo de inestimable ayuda en la selección de que aquellos pacientes tributarios de una biopsia intestinal. El gluten El gluten, que desde mediados de este siglo se ha identificado como el elemento precipitante de la enfermedad, es una compleja mezcla de proteínas que según la definición más antigua consiste en la parte pegajosa que queda cuando la harina de trigo (también otros cereales, como centeno. cebada, etc.) se lava con agua para eliminar de ella los gránulos de almidón y otros constituyentes solubles. Dependiendo de la intensidad del lavado, el sólido seco está constituido por un 75 - 85% de proteínas, un 5-10% de lípidos y pequeñas trazas de hidratos de carbono. La parte proteica del gluten se puede separar groseramente, según su solubilidad en etanol 40-70%, en prolaminas (solubles) y gluteninas (insolubles). Las prolaminas (gliadinas en el trigo, secalinas en el centeno, hordeinas en la cebada y aveninas en la avena) son fundamentalmente proteínas monoméricas (unas 40 en el caso del trigo) mientras que las gluteninas comúnmente se encuentran agregadas. La única función biológica conocida de estas proteínas que se encuentran en el endoesperma de las semillas es la de sillares de almacenamiento de los cereales. Osborne en 1924 precisó la definición de las prolaminas especificando que estas son la parte de las proteínas de almacenamiento de los cereales solubles en etanol-H2O sin reducción de los enlaces disulfuros siendo la parte insoluble las gluteninas. Esta definición sirvió durante muchos años pero hoy sabemos que el criterio de solubilidad no establece una separación precisa de los dos grupos de proteínas. Las clasificación más rigurosa de las proteínas del gluten se basa en las movilidades en geles de poliacrilamida de bajo pH y además en la estructura primaria. Por estos critérios se definen tres grupos: Las de alto peso molecular (subunidades x e y de las gluteninas), las de peso molecular medio (las subunidades  de las prolaminasy las de bajo peso molecular (subunidades  y  de las prolaminas y la subunidad de bajo peso molecular de las gluteninas). En cada una de las subunidades se encuentra un complejo grupo de proteínas que comparten una relativa homología en secuencia y al mismo tiempo elementos estructurales únicos. Hoy en día es comúnmente aceptado que la toxicidad del gluten para los celiacos está contenida en todas las fracciones,   y  las prolaminas, aunque en los últimos tiempos se han reportados resultados que implican también a las gluteninas. Esto último, probablemente,. podría explicarse por contaminaciones durante el proceso de separación; o por la posible existencia de complejos macromoleculares formados por gluteninas  gliadinas. La toxicidad de las fracciones ,   y  de las prolaminas se conserva aún después de calentarlas (alimentos manufacturados a partir de harinas) o someterlas a procesos enzimáticos (naturalmente llegan al intestino después de ser digeridas en el estómago por varios enzima), por ello la mayoría de los estudios encaminados a esclarecer la implicación de estas proteínas en la EC, se centran sólo en su estructura primaria. Existen muy fundadas sospechas de que no existe en todo este complejo proteico (el gluten) una única estructura, un péptido o estructura secundaria específica responsable de disparar el desarrollo de la EC. Hasta el momento se han reportados 4 secuencias de gliadinas (péptidos) que “in vitro”, muestran ser epítopos T capaces de activar en estas condiciones una respuesta proliferativa específica de células T aisladas del intestino de pacientes celiacos. Se ha demostrado de igual modo que en los enfermos celiacos no tratados existe una respuesta de células B oligoclonal siendo las clases de Acs IgAs e IgGs mayoritarias. Esta alta complejidad del antígeno potencialmente tóxico para los enfermos celiacos, constituye un fuerte “handicap”, para el estudio de la etiología y la patología de esta enfermedad. En años recientes se han reportado algunos trabajos que en conjunto han logrado avanzar mucho en esta dirección, pero aún hoy en día la única herramienta segura para el tratamiento de la enfermedad continua siendo la eliminación del gluten de la dieta de los individuos de riesgo. Desde el punto de vista tecnológico esto significa eliminar de los productos alimenticios destinados a los EC, los cereales comprometidos. En este último sentido se han realizado muchos intentos de desarrollar sistemas para la cuantificación del gluten en muestras de alimentos tanto basados en técnicas inmunológicas (ELISA con Acs específicos e inmunobloting) y técnicas no inmunológicas como HPLC cuantitativa o espectrometría de masas. Las técnicas inmunológicas requieren Acs con un amplio espectro de reconocimiento para asegurar cuantificar en igual medida las proteínas de trigo, cebada, centeno y avena y al mismo tiempo posean la especificidad suficiente para no presentar reacción cruzada con proteínas no relacionadas como las del maíz y el arroz que son cereales no tóxicos. En nuestro laboratorio hemos desarrollado varios sistemas tipo ELISA con Ac monoclonales con una alta sensibilidad y una muy buena especificidad por las proteínas provenientes de los cereales; consideraciones prácticas exigen que los Acs que se pretendan utilizar para este propósito deben reconocer con afinidad parecida todas las proteínas del complejo (gluten). Nb Nuestro objetivo ha sido el desarrollo de nuevas técnicas de detección de gluten en alimentos que permitan a los enfermos celiacos realizar una dieta estrictamente libre de gluten, que es el único tratamiento viable en la actualidad contra esta enfermedad. Tratamiento de la enfermedad Celiaca El único *tratamiento* posible para los pacientes celiacos es el seguimiento de una *dieta estrictamente exenta de gluten,* lo cual implica la ingesta exclusiva de alimentos sin gluten por vida. Actualmente, el contenido de gluten en alimentos se determina por métodos tipo ELISA, comerciales o caseros, que emplean anticuerpos monoclonales o policlonales frente a una gran variedad de componentes de trigo (extractos, fracciones o péptidos sintéticos de gliadinas). No obstante, la comparación del contenido de gluten proporcionado por los distintos formatos de ELISA, especialmente para contenidos bajos de gluten cercanos al umbral tóxico, revela la inconsistencia de estos métodos, que en consecuencia resultan ser poco fiables. Además, los únicos kits comerciales actuales tipo ELISA utilizados para el control de gluten en alimentos están basados en un anticuerpo monoclonal contra la -gliadina de trigo y sólo detectan el gluten de trigo y centeno, mientras que son insensibles al gluten de cebada y de avena. Esto representa uno de los mayores problemas a la hora de controlar la dieta, ya que a menudo estos pacientes son consumidores larvados de sustancias tóxicas provenientes de cebada o avena presentes como contaminantes en alimentos etiquetados como libres de gluten. La ingesta de estas sustancias tóxicas sin controlar hace que potencialmente los enfermos celiacos pueden desarrollar neoplasias en la edad adulta. Lamentablemente, el método definitivo que garantice un modo de controlar el contenido exacto de gluten está, hoy en día, sin resolver. En consecuencia, el desarrollo de procedimientos alternativos y/o complementarios a los inmunológicos es del máximo interés. Métodos desarrollados en el Centro Nacional de Biotecnología : En los últimos dos años nuestro Grupo del CNB ha desarrollado tres importantes aportaciones claves en la analítica del gluten. Desde entonces se ha convertido en centro de referencia de análisis de alimentos para celiacos a nivel europeo. Los métodos desarrollados en el CNB son: 1) Un innovador cocktail sandwich ELISA basado en tres anticuerpos monoclonales que permite detectar por primera vez cebada al mismo nivel que trigo y centeno con una sensibilidad de 1.5 ppm de gluten; 2) el único ELISA competitivo específico de avena con una sensibilidad de 8 ppm; y 3) la primera técnica no inmunológica descrita complementaria a los métodos inmunológicos para el análisis de gluten en alimentos basada en la Espectrometría de Masas MALDI-TOF. Este sistema permite en tan sólo unos minutos la identificación directa de gluten de trigo, cebada, centeno y avena. Esta técnica de la que nuestro grupo ha sido pionera en aplicarla al análisis de gluten, permite confirmar resultados obtenidos por ELISAs y descartar posibles falsos positivos. Estas técnicas complementarias constituyen hoy en día las más avanzadas en sensibilidad y selectividad para la caracterización y cuantificación del gluten en alimentos elaborados con trigo, cebada, centeno y avena. Ultimas novedades y aportaciones en el 2000 4) Desarrollo del sandwich ELISA R5 Se ha puesto a punto un sandwich ELISA R5 basado en el empleo de un único anticuerpo monoclonal R5 que permite la detección de manera simultánea de gluten de trigo, cebada y centeno en alimentos con un límite de detección de 1.5 ppm de gluten. Este ELISA representa el sistema más especifíco y sensible para la detección de gluten de trigo , de cebada y de centeno descrito hasta la fecha. Otra de las novedades del anticuerpo R5 es que reconoce específicamente una región de aminoácidos QQPFP descrita como “potencialmente tóxica” en experimentos “in vivo” e “in vitro” y que está muy repetida en todas las fraccionesy de gliadinas. De confirmarse estos resultados, el R5 sería un anticuerpo ideal específico de los componentes tóxicos de gluten que desencadenan la Enfermedad Celiaca. 5) Método general de extracción de gluten en alimentos procesados por calor Uno de los avances realizado en los últimos meses en el CNB ha sido el desarrollo de un método general de extracción de gluten válido para alimentos no procesados y procesados por calor que libera cuantitativamente todo el gluten y que es compatible con el ELISA, Western blot y Espectrometría de Masas.. Este nuevo procedimiento de extracción de momento “único” en nuestro laboratorio del CNB, está siendo ya utilizado rutinariamente en alimentos para celiacos. Este nuevo procedimiento de extracción permite solubilizar el gluten y extraerlo cuantitativamente de los alimentos procesados por calor con una eficacia muy superior a la extracción convencional con 60 % etanol-agua.

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