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	PROBLEMAS GENERALES RELACIONADOS CON LA ANALÍTICA DEL GLUTEN (II)
	¿Por qué las técnicas disponibles no garantizan el control del gluten en alimentos para celiacos?: Nuevas tecnologías. Enrique Méndez Centro Nacional de Biotecnología
	. Se desconocen los niveles de gluten que pueden tolerar los pacientes celiacos y qué componentes tóxicos del gluten (prolaminas del trigo, de cebada, de centeno y de avena) son los desencadenantes de la Enferemedad Celiaca. . Los componentes tóxicos se encuentran sólo en cuatro cereales: el trigo, la cebada, el centeno y la avena (la avena se encuentra en proceso de investigación para saber si es o no tóxica). . Cada variedad de trigo, de cebada, de centeno o de avena contiene “cientos” de estos componentes tóxicos del gluten que se denominan prolaminas y se clasifican en alfa, beta, gamma y omega (gliadinas-trigo), (hordeinas-cebada), (secalinas-centeno) y (aveninas-avena). El porcentaje y composición de estas prolaminas es muy diferente en cada variedad, representando la fracción de las omegas el 5-20 % del total de prolaminas. . La composición y fórmula es muy heterogénea y diferente entre alimentos (contienen además de las contaminaciones de gluten, sales, azúcares, grasas, proteínas de otros cereales, colorantes, aditivos etc.). . Además, el gluten puede estar en alimentos sólidos (galletas, papillas, chocolates etc), líquidos o semi-líquidos (leches, yogures, siropes, etc). . Durante el proceso de elaboración muchos alimentos son sometidos al calor o a procesos enzimáticos. Como consecuencia, el gluten de estos alimentos se altera, se modifica, se hace insoluble y/o se hidroliza total o parcialmente. . El éxito de la detección del gluten en alimentos radica de una manera directa en la capacidad del método de extracción que se utilice. . El principal problema es ¿cómo extraer con eficacia el gluten de estos alimentos tan heterogéneos elaborados para celiacos? . El método convencional de extracción de gluten en un alimento se realiza con alcohol/agua 60%. . ¿Es eficaz el sistema de extracción con alcohol/agua 60% para los alimentos sólidos, líquidos o semi-líquidos? . El sistema de extracción con 60 % etanol-agua “no permite” extraer con eficacia el gluten insolubilizado de los alimentos procesados por el calor (que representan alrededor del 80 % de los alimentos que toman los pacientes celiacos). . Actualmente, no se dispone de métodos de extracción que permitan extraer el 100 % del gluten de los diferentes tipos de alimentos y en particular de aquellos procesados con calor en los que el gluten esta insolubilizado. Como consecuencia, los valores de gluten extraídos de alimentos procesados por calor e independientmente del ELISA utilizado pueden estar muy subestimados. . Los métodos inmunológicos basados en anticuerpos (tipo ELISA o Western) son los más utilizados para determinar los niveles de gluten en los alimentos. Ocasionalmente, pueden originar falsos positivos por lo que es imprescindible el desarrollo de métodos alternativos no-immunológicos para analizar el gluten. . Los ELISAs disponibles y más utilizados en toda Europa están basados en un anticuerpo contra la omega-gliadina de trigo, desarrollado por Skerrit. Debido a que la fracción de omegas representa un porcentaje muy pequeño del total de las prolaminas, y su composición difiere entre variedades, los resultados de este tipo de ELISA son muy inconsistentes y dependientes de la variedad utilizada en el alimento. Estos kits-ELISA comercializados en tres formatos diferentes,“no detectan cebada ni avena” y su sensibilidad dependiendo del tipo de Kit comercial varía entre 20-40 ppm. . Esto es un problema, porque el no disponer de sistemas fiables de detección de gluten origina que en los países europeos no existan normativas legales que definan y regulen niveles de gluten en alimentos para celíacos. Las Industrias no pueden controlar con precisión contaminaciones de gluten en los alimentos que elaboran y el Codex Alimentarius no puede recomendar métodos oficiales por no disponer de sistemas capaces de detectar niveles de gluten de trigo, de cebada, de centeno y de avena con fiabilidad en cuanto a ppm. . A pesar de que éste fue un método recomendado a nivel internacional, en los últimos años se ha comprobado que su fiabilidad es muy limitada. Un método de ELISA puede ser evaluado y recomendado hoy, y pasado el tiempo comprobar que su eficacia no era la esperada. Esto es lo que ha pasado con todos los kits de ELISA basados en el anticuerpo de Skerrit. . Pero si hablamos de la salud de los pacientes celiacos, lo importante es utilizar el método disponible que garantice con la máxima fiabilidad el control de los alimentos, independientemente de que exista otro que, en su momento, fue validado pero que se ha quedado. . Este kit de ELISA basado en el anticuerpo de Skerrit es el que hoy día recomienda FACE. Yo no voy a entrar a discutir la oficialidad de un método o de un laboratorio, porque actualmente todo es cuestionable. A pesar de que FACE ha sido informada repetidamente por nuestro grupo de las limitaciones de estos ELISAs, todavía prefiere analizar alimentos en laboratorios que utilizan estos ELISAs, en los que no detectan ni cebada ni avena y ni siquiera pueden analizar con fiabilidad productos elaborados con calor. Pero debería explicar a la comunidad celiaca el significado del logotipo “controlado por FACE” ¿Qué controla FACE? ¿controla la cebada, la avena, o el gluten de alimentos procesados por calor? ¿Quién avala científicamente a FACE? Como grupo científico, es nuestra obligación informar al colectivo de celiacos, que en nuestra opinión, por las limitaciones mencionadas de los ELISAs, el etiquetado de “controlado por FACE” no garantiza con fiabilidad el contenido de gluten de los alimentos elaborados para celiacos. El etiquetado de los alimentos referente al contenido o no de gluten reviste por ello, y muy especialmente en el momento actual, una gran complejidad. ¿Tiene FACE herramientas científicas fiables y competencia legal para controlar el gluten en alimentos para celiacos?, ¿Es realmente fidedigna la información que se ofrece al usuario en revistas especializadas? En nuestra opinión, debe ser un organismo con capacidad tecnológica demostrable quien realice la validación con todas las garantías y asuma todas las responsabilidades. . El único tratamiento para los pacientes celiacos es el seguimiento por vida de una dieta estrictamente exenta de gluten. . ¿Pueden las técnicas disponibles detectar con precisión la presencia de mínimas contaminaciones de gluten que pueden tener efectos no deseables para el paciente celiaco?, ¿Está garantizada la salud del celiaco con los alimentos comerciales que el celiaco consume habitualmente en nuestro país? . Todos estas dudas responden al título de la Reunión Anual Gluten 2001. ¿Por qué las técnicas disponibles no garantizan el control del gluten en alimentos para celiacos? Nuevas tecnologías . Lamentablemente, el método definitivo que garantice un modo de controlar el contenido exacto de gluten está, hoy en día, sin resolver. En consecuencia, el desarrollo de nuevos métodos inmunológicos y no-inmunológicos es del máximo interés. Desde hace varios años nuestro grupo ha desarrollado y optimizado nuevos métodos alternativos inmunológicos y no-inmunológicos que utilizamos rutinariamente para analizar el gluten: 1.- *Un ELISA competitivo específico de avena* con una sensibilidad de 10 ppm. 2.- La primera técnica no inmunológica descrita complementaria a los métodos inmunológicos para el análisis de gluten en alimentos basada en la *Espectrometría de Masas MALDI-TOF* con una sensibilidad de 10-50 ppm. Este sistema permite en tan sólo unos minutos la identificación directa de gluten de trigo, cebada, centeno y avena. La técnica permite confirmar resultados obtenidos por ELISAs y descartar posibles falsos positivos. 3.- Hemos puesto a punto un sistema de *Western blot* desarrollado con el anticuerpo R5 por inmunodetección con ECL con una sensibilidad de 2-5 ppm. 4.- Disponemos de un *sandwich ELISA R5* basado en el empleo de un único anticuerpo monoclonal R5 que permite la detección de gluten de trigo, cebada y centeno en alimentos con un límite de detección de 1.5 ppm de gluten (0.75 ppm gliadinas). Una de las ventajas de este ELISA es que detecta el gluten de cebada de la misma manera que el de trigo y centeno. Otra de las novedades del anticuerpo R5 es que reconoce específicamente una región de aminoácidos QQPFP (glutamina, glutamina, prolina, fenilalanina, prolina) descrita como “potencialmente tóxica” en experimentos in vivo e in vitro. De confirmarse estos resultados, el R5 sería un anticuerpo que reconocería específicamente los componentes tóxicos de gluten que desencadenan la Enfermedad Celiaca. Esta región de aminoácidos está muy repetida en todas las fracciones alfa, beta, gamma y omega. La ventaja de R5 es que reconoce todas las fracciones tóxicas del gluten en contraste con el anticuerpo de Skerrit que reconoce específicamente sólo la fracción de las omegas. 5.- *Procedimiento cuantitativo de extracción de gluten* Desgraciadamente, la poca sensibilidad y especificidad de las técnicas disponibles de ELISA para la cuantificación de gluten en alimentos, imposibilitan actualmente un tratamiento eficaz para el paciente celiaco. Pero el problema se agudiza porque el 80-90 % de los alimentos “sin gluten” que se comercializan son procesados a altas temperaturas 100-230 0C. Durante el proceso de elaboración de estos alimentos, el gluten contaminante se desnaturaliza por el calor, se insolubiliza y sólo un porcentaje muy pequeño entre 10-30 % es extraído con el sistema convencional de extracción: etanol/agua. Cómo consecuencia, los niveles de gluten extraídos de estos alimentos con este tipo de extracción e independientemente de los ELISAs utilizados, están muy subestimados. Esta limitación ha hecho que hasta la fecha, en nuestro país y fuera de nuestro país, no se pueda garantizar el contenido de gluten de la mayoría de los productos dietéticos “sin gluten” que consumen los celiacos y que en su mayoría son los procesados con calor. Nuestro laboratorio del Centro Nacional de Biotecnolgía (CNB) ha desarrollo recientemente un procedimiento cuantitativo de extracción de gluten denominado *“cocktail”* de gran eficacia, diseñado especialmente para alimentos “sin gluten” procesados a altas temperaturas. El sistema permite obtener rendimientos del 100 % de gluten, en alimentos procesados a altas temperaturas y no procesados por calor, en contraste con los bajos rendimientos del 10-30 % del sistema convencional de extracción con etanol/agua. Además el “cocktail” es compatible con otras técnicas complementarias de análisis de gluten: ELISA, Western y Espectrometría de Masas MALDI-TOF. La combinación del *“cocktail”* con el sistema de cuantificación ELISA-R5 desarrollado en el Centro Nacional de Biotecnología (CNB) permite garantizar con fiabilidad la detección de niveles de gluten de trigo, cebada y de centeno de manera simultánea a niveles de detección de 1.5 partes por millón en alimentos para celiacos procesados y no procesados a altas temperaturas. La existencia de esta nueva tecnología obligará a revisar todos los listados de alimentos para celiacos que se venden en nuestro país en particular aquellos elaborados a altas temperaturas cuyos niveles están muy por debajo del valor real debido a la poca eficiencia del sistema de extracción convencional de etanol/agua utilizado. Ultimas novedades 6.- Actualmente, estamos testando y optimizando un nuevo sistema visual inmunocromatográfico de tiras, rápido, sencillo que permite detectar niveles de 0.5 ppm de gluten en tan sólo 5 minutos después del proceso de extracción. El sistema es compatible con 60 % etanol-agua y con los reactivos del cocktail de extracción. Esperamos que en un corto periodo de tiempo esta nueva tecnología pueda incorporarse como una pieza clave en la analítica del gluten. El conjunto de estas seis técnicas complementarias: *ELISA competitivo específico de avena, Espectrometría de Masas MALDI-TOF, Western, sandwich ELISA R5, procedimiento de “cocktail* *de extracción cuantitativo de gluten y sistema* *inmunocromatigráfico* constituyen hoy en día las herramientas más avanzadas en sensibilidad y selectividad para la caracterización y cuantificación del gluten en alimentos contaminados con trigo, cebada, centeno y avena y están permitiendo controlar de una manera más fiable la dieta de los enfermos celiacos. Prototipo: Actualmente, una empresa española Ingenasa y otra alemana especializadas, se encargan de desarrollar un *“prototipo”,* es decir, convertir este ELISA R5 de laboratorio en un kit listo para ser comercializado. Los kits estan siendo optimizados con la incorporación i) del nuevo Estandar Europeo de gliadinas propuesto por el grupo europeo Prolamin Group y ii) del sistema de cocktail de extracción válido para alimentos procesados y no procesador por calor. A lo largo de este año 2001 pretendemos evaluar el “prototipo” del ELISA R5 con 12-15 laboratorios europeos, de acuerdo con las normas de la AOAC internacional, tal y como se propuso en la sesión 22 del Codex Alimentarius en Berlín del 2000 (a la que asistimos el Dr.Martin Stern y yo como representantes del grupo europeo Prolamin Group). Este año, una vez más el Dr. Martin Stern y yo presentaremos los datos disponibles sobre el ensayo europeo, en la sesión plenaria del Codex que se celebrará el 26-27 de Noviembre de 2001 en Berlín En principio, nuestro ELISA-R5 es superior en sensibilidad y especificidad a la del ELISA basado en el anticuerpo de Skerrit y deseamos que el kit se comercialice por su eficacia y se pueda validar, aunque en el futuro posiblemente aparezcan nuevas tecnologías y otros anticuerpos, de mayor sensibilidad y específicidad que sustituyan al nuestro. Unidad de Detección de Gluten en el Centro Nacional de Biotecnología. Recientemente se ha oficializado la Unidad de Detección de Gluten en el Centro Nacional de Biotecnología, que lleva dando Servicio desde hace más de dos años a un total de 42 empresas nacionales e internacionales que producen y comercializan alimentos para celiacos, incluyendo Organismos Oficiales como las Consejerías de Comunidades Autónomas de la Junta de Andalucía, Castilla-La Mancha, Asociación de Celiacos de Cataluña, y el Ministerio de Sanidad y Consumo y en breve con Comunidad de Canarias. Desde comienzo del 2000 se han incorporado a esta lista 15 nuevas empresas europeas principalmente fabricantes de almidón (la AAC) y empresas de fabricación de productos para celiacos. En tan sólo dos años se han procesado unos 3000 alimentos. Este año se ha dotado al Servicio de Gluten de un equipo de Espectrometría de Masas MALDI-TOF que ha sido co-financiado por el CNB, el CSIC y una ayuda de infraestructura de la Dirección General de Investigación de la Comunidad Autónoma de Madrid (CAM). Actualmente está en marcha el proceso de implantación de un Sistema de Calidad ISO/17025/2000-12-05, gestionado y financiado por el CSIC y la Comunidad de Madrid. La Unidad de Detección de Gluten cuenta con tres titulados superiores que se encargan de realizar los procesos de extracción, ELISAs, Westerns, Espectrometría de Masas . Además, han sido los responsables de la optimización de las técnicas desarrolladas en la Unidad de Gluten. Esta Unidad de investigación y control de la dieta en la enfermedad celiaca, aparte de estar al servicio del CNB y de la I+D de nuestro grupo y otros potenciales, será puesto a disposición de departamentos hospitalarios, industriales y de cualquier organismo con competencia en áreas de alimentación y sanitaria. La creación de un Servicio de análisis de gluten, además de su objetivo científico, va a tener un claro beneficio social. Es indudable que el éxito de los proyectos a los que el Servicio atenderá, tendrá un impacto positivo en la industria de alimentos y, más específicamente, a la dedicada a la dieta para enfermos celiacos. Hoy día, el análisis de gluten en alimentos no es trivial ni rutinario, aún quedan muchas preguntas sin contestar cuyas respuestas, al menos en los próximos cinco años, tendrán que ser contestadas en laboratorios muy especializados como el nuestro del CNB.

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