{"id":84070,"date":"2008-02-08T05:41:00","date_gmt":"2008-02-08T05:41:00","guid":{"rendered":"http:\/\/weblogs.madrimasd.org\/\/alimentacion\/archive\/2008\/02\/08\/84070.aspx"},"modified":"2008-02-08T05:41:00","modified_gmt":"2008-02-08T05:41:00","slug":"metodos-rapidos-y-automatizacion-en-microbiologia-alimentaria-yii","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.madrimasd.org\/blogs\/alimentacion\/2008\/02\/08\/84070","title":{"rendered":"M\u00e9todos r\u00e1pidos y automatizaci\u00f3n en microbiolog\u00eda alimentaria (yII)"},"content":{"rendered":"

Los m\u00e9todos r\u00e1pidos y automatizados en microbiolog\u00eda de los alimentos requieren un tiempo reducido para la obtenci\u00f3n de los resultados en comparaci\u00f3n con los m\u00e9todos \u201cconvencionales\u201d, y son f\u00e1ciles de usar, precisos y econ\u00f3micamente rentables. En la primera parte de este blog se describieron las innovaciones introducidas recientemente en los m\u00e9todos empleados para el recuento de las c\u00e9lulas viables y la medici\u00f3n de la biomasa. En esta segunda parte, se tratan las referidas a los sistemas miniaturizados y kits de diagn\u00f3stico, y a los m\u00e9todos inmunol\u00f3gicos y gen\u00e9ticos. <\/FONT><\/P>

Sistemas miniaturizados y kits de diagn\u00f3stico<\/o:p><\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P>

Los sistemas miniaturizados surgen a partir del concepto de la placa microtituladora (96 pocillos, formato 8×12), que permite reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos, as\u00ed como estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran n\u00famero de aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado. Esta l\u00ednea de investigaci\u00f3n ha permitido desarrollar algunos de los medios de cultivo selectivos que se encuentran en el mercado actualmente. Entre los sistemas miniaturizados de identificaci\u00f3n microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos espec\u00edficos por parte de los microorganismos y su detecci\u00f3n mediante diversos sistemas indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables para la identificaci\u00f3n sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioqu\u00edmicas r\u00e1pidas (O.B.I.S<\/A>., Oxoid); galer\u00edas que permiten la identificaci\u00f3n de m\u00e1s de 800 especies de bacterias y levaduras (API<\/A>, bioM\u00e9rieux); tubos de pl\u00e1stico con compartimentos que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculaci\u00f3n del tubo de forma r\u00e1pida y sencilla a partir de una \u00fanica colonia (BBL Enterotube y Oxi\/Ferm Tube<\/A>, BD); y soportes pl\u00e1sticos con pocillos de f\u00e1cil inoculaci\u00f3n que contienen sustratos cromog\u00e9nicos y\/o fluorog\u00e9nicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal<\/A>, BD; RapID systems<\/A> y MicroID<\/A>, Remel; Biochemical ID systems<\/A>, Microgen). <\/FONT><\/SPAN><\/P>

<\/v:stroke><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:f><\/v:formulas><\/v:path><\/o:lock><\/v:shapetype>\"Dr.<\/FONT><\/v:imagedata> <\/v:shape><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR>

El Dr. Fung, pionero de la miniaturizaci\u00f3n en microbiolog\u00eda de los alimentos<\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR><\/TBODY><\/TABLE>

Uno de los sistemas miniaturizados y automatizados m\u00e1s conocidos y sofisticados es el sistema VITEK<\/A> (bioM\u00e9rieux) que, bas\u00e1ndose en cambios de color de los sustratos o en la producci\u00f3n de gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta pl\u00e1stica que contiene los sustratos bioqu\u00edmicos en forma deshidratada, puede identificar un cultivo t\u00edpico de Escherichia coli en 2-4 h. Una rapidez similar en la obtenci\u00f3n de resultados puede obtenerse con el sistema Biolog<\/A> (AES Chemunex) que detecta la capacidad de los microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono. Los 295 (4×1028) patrones metab\u00f3licos posibles permiten, adem\u00e1s de la identificaci\u00f3n, el establecimiento de relaciones filogen\u00e9ticas entre distintos aislados. El empleo de un \u00fanico crom\u00f3geno como indicador r\u00e9dox, el violeta de tetrazolio, que se reduce de forma irreversible a formaz\u00e1n (color violeta) como consecuencia de la actividad metab\u00f3lica bacteriana, facilita la lectura visual de los resultados. En cualquier caso, la mayor\u00eda de los sistemas citados en esta secci\u00f3n ofrecen la posibilidad de lectura e interpretaci\u00f3n de resultados de manera autom\u00e1tica. <\/o:p><\/FONT><\/P>

M\u00e9todos Inmunol\u00f3gicos <\/o:p><\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P>

Los m\u00e9todos inmunol\u00f3gicos se basan en la reacci\u00f3n espec\u00edfica entre un ant\u00edgeno y un anticuerpo policlonal o monoclonal. En microbiolog\u00eda de los alimentos, el m\u00e9todo inmunol\u00f3gico m\u00e1s empleado para la detecci\u00f3n de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA<\/A> (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo s\u00e1ndwich. En los \u00faltimos a\u00f1os, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la detecci\u00f3n de Salmonella<\/EM>, E. coli<\/EM> O157:H7, Listeria monocytogenes<\/EM>, Campylobacter <\/EM>spp. y toxinas estafiloc\u00f3cicas (Assurance EIA<\/A> y TRANSIA PLATE<\/A>, Biocontrol; TECRA VIA<\/A>, Biotrace International; Salmonella UNIQUE<\/A>, Tecra; Detex<\/A>, Molecular Circuitry Inc.). Un n\u00famero considerable de laboratorios de microbiolog\u00eda de los alimentos emplea instrumentos automatizados basados en una variante de la tecnolog\u00eda ELISA conocida como ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacci\u00f3n es fluorescente en lugar de cromog\u00e9nico, para la detecci\u00f3n de los pat\u00f3genos alimentarios mencionados (VIDAS<\/A>, bioM\u00e9rieux). <\/o:p><\/FONT><\/P>

\"M\u00e9todos<\/FONT><\/v:imagedata> <\/v:shape><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR>

La separaci\u00f3n inmunomagn\u00e9tica (1) emplea part\u00edculas paramagn\u00e9ticas recubiertas de anticuerpos espec\u00edficos. Puede utilizarse para separar y concentrar los microorganismos presentes en los alimentos antes de realizar un ELISA (2)<\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR><\/TBODY><\/TABLE>

En ocasiones, se utiliza la t\u00e9cnica de separaci\u00f3n inmunomagn\u00e9tica<\/A> (SIM), que emplea part\u00edculas magn\u00e9ticas recubiertas de anticuerpos espec\u00edficos (Dynabeads<\/A>, Dynal), para concentrar el ant\u00edgeno de inter\u00e9s como etapa previa a la realizaci\u00f3n del ELISA. La SIM permite reducir el tiempo requerido para el enriquecimiento de la muestra, as\u00ed como obtener suspensiones que contienen menor cantidad de part\u00edculas del alimento, lo que facilita su procesado posterior mediante distintas t\u00e9cnicas (hibridaci\u00f3n con sondas g\u00e9nicas, PCR, etc.). Para laboratorios con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits de diagn\u00f3stico basados en el principio de la inmunocromatograf\u00eda de flujo lateral caracterizados por ser r\u00e1pidos, sencillos y no requerir instrumentaci\u00f3n especial (VIP<\/A>, Biocontrol; Reveal<\/A>, Neogen; RapidChek<\/A>, Strategic Diagnostics). Otro tipo de ensayos inmunol\u00f3gicos r\u00e1pidos y listos para usar son los basados en la inmunodifusi\u00f3n en un vial de agar para la detecci\u00f3n r\u00e1pida de serovares m\u00f3tiles de Salmonella<\/EM> (1-2 Test<\/A>, Biocontrol) o en la aglutinaci\u00f3n reversa pasiva con part\u00edculas de l\u00e1tex para la detecci\u00f3n de microorganismos pat\u00f3genos (Microscreen<\/A>, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA<\/A> kits, Oxoid).<\/o:p> <\/FONT><\/P>

M\u00e9todos Gen\u00e9ticos <\/o:p><\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P>

A diferencia de los m\u00e9todos citados en las secciones anteriores, que detectan caracter\u00edsticas fenot\u00edpicas sujetas de manera natural a variaci\u00f3n, los m\u00e9todos gen\u00e9ticos se dirigen a la detecci\u00f3n de caracter\u00edsticas celulares mucho m\u00e1s estables contenidas en los \u00e1cidos nucleicos. Una t\u00e9cnica para detectar dichas caracter\u00edsticas en ausencia de instrumentaci\u00f3n especializada es la hibridaci\u00f3n de \u00e1cidos nucleicos<\/A>. Los ensayos comerciales actuales emplean sondas gen\u00e9ticas (oligonucle\u00f3tidos sint\u00e9ticos) marcadas enzim\u00e1ticamente que, tras hibridar con regiones espec\u00edficas del ARN ribos\u00f3mico (una c\u00e9lula bacteriana puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribos\u00f3mico frente a una \u00fanica copia de ADN cromos\u00f3mico), catalizan una reacci\u00f3n que da lugar a un producto coloreado a partir de un sustrato cromog\u00e9nico, lo que es indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento (GeneQuence<\/A>, Neogen). En los \u00faltimos a\u00f1os es cada vez m\u00e1s frecuente en los laboratorios de microbiolog\u00eda de los alimentos el empleo de la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR<\/A>) para amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer as\u00ed de una cantidad suficiente que permita su detecci\u00f3n. Se trata de una t\u00e9cnica espec\u00edfica, sensible (en teor\u00eda, puede detectar una \u00fanica copia del ADN diana en el alimento; en la pr\u00e1ctica se necesitan unas 103 ufc\/ml para una detecci\u00f3n reproducible) y r\u00e1pida, a lo que contribuye el desarrollo de metodolog\u00edas alternativas de detecci\u00f3n de los productos de PCR que evitan el procesamiento post-reacci\u00f3n. Dichas metodolog\u00edas est\u00e1n basadas en el empleo de agentes intercalantes (por ejemplo, SYBR Green<\/A>) o sondas espec\u00edficas con doble marcaje fluorescente que, adem\u00e1s de posibilitar la \u201cvisualizaci\u00f3n\u201d del progreso de la reacci\u00f3n, facilitan la automatizaci\u00f3n del proceso y permiten la cuantificaci\u00f3n de la cantidad de DNA diana presente inicialmente en la muestra (PCR cuantitativo en tiempo real<\/A>). <\/FONT><\/P>

\"PCR<\/FONT><\/v:imagedata> <\/v:shape><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR>

La t\u00e9cnica de PCR cuantitativo en tiempo real puede emplearse para la detecci\u00f3n y cuantificaci\u00f3n de: (1) microorganismos pat\u00f3genos en los alimentos; (2) alimentos modificados gen\u00e9ticamente; (3) fraude por sustituci\u00f3n de especies en productos de elevado valor comercial<\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P><\/TD><\/TR><\/TBODY><\/TABLE>

A pesar de tratarse de una t\u00e9cnica sofisticada, el empleo de la t\u00e9cnica de PCR en tiempo real en el laboratorio de microbiolog\u00eda de los alimentos se est\u00e1 viendo facilitado en los \u00faltimos a\u00f1os por el desarrollo de sistemas para la detecci\u00f3n de pat\u00f3genos de los alimentos que son f\u00e1ciles de utilizar, requieren una manipulaci\u00f3n m\u00ednima y reducen la necesidad de interpretaci\u00f3n de los resultados (BAX Q7<\/A>, Du Pont Qualicon; iQ-Check<\/A>, Bio-Rad; TaqMan Pathogen Detection Kits<\/A>, Applied Biosystems; Roche\/Biotecon Diagnostics LightCycler<\/A>, Roche; Warnex<\/A>, AES Chemunex). La t\u00e9cnica de PCR cuantitativo en tiempo real es una de las opciones m\u00e1s prometedoras en los laboratorios de control de calidad de los alimentos, no solo para la identificaci\u00f3n y cuantificaci\u00f3n de microorganismos, sino tambi\u00e9n para la determinaci\u00f3n de la presencia de organismos modificados gen\u00e9ticamente en materias primas y productos terminados y para la autentificaci\u00f3n<\/A> de productos en los que pueda producirse un fraude por sustituci\u00f3n de especies por otras de menor valor comercial.<\/FONT><\/P>

La investigaci\u00f3n epidemiol\u00f3gica de brotes alimentarios y la monitorizaci\u00f3n rutinaria de microorganismos en el ambiente requiere sistemas que sean capaces de identificar los microorganismos m\u00e1s all\u00e1 del nivel de especie. Para ello, partiendo de una colonia de cultivo puro, pueden emplearse procedimientos automatizados basados en la hibridaci\u00f3n de sondas espec\u00edficas con fragmentos de restricci\u00f3n del ADN (Riboprinter<\/A>, DuPont Qualicon) o t\u00e9cnicas m\u00e1s dif\u00edcilmente automatizables y que requieren analistas cualificados para su realizaci\u00f3n e interpetaci\u00f3n (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE<\/A>; MultiLocus Sequence Typing, MLST<\/A>).<\/FONT><\/P>

Sumario y perspectivas <\/o:p><\/FONT><\/SPAN><\/B><\/P>

Los m\u00e9todos r\u00e1pidos y automatizados en microbiolog\u00eda de los alimentos representan un \u00e1rea de la microbiolog\u00eda aplicada en continua expansi\u00f3n. La rapidez en la obtenci\u00f3n de resultados es esencial en la industria alimentaria para reducir los tiempos de espera en los procesos de producci\u00f3n y liberar m\u00e1s r\u00e1pidamente los lotes producidos. Adem\u00e1s, la rapidez es fundamental en un programa de APPCC exitoso, ya que permite la aplicaci\u00f3n de acciones correctoras durante el procesado de los alimentos. El tiempo ahorrado mediante el empleo de estos m\u00e9todos puede utilizarse para otras tareas tales como revisar el plan de APPCC, ampliar los planes de control de pat\u00f3genos y de an\u00e1lisis qu\u00edmicos (micotoxinas, antibi\u00f3ticos, al\u00e9rgenos, etc.), formar a los empleados en los riesgos microbiol\u00f3gicos, etc.

Aunque en la actualidad la mayor\u00eda de las t\u00e9cnicas r\u00e1pidas se dirigen a la detecci\u00f3n de bacterias, es previsible que se desarrollen nuevos m\u00e9todos para la identificaci\u00f3n r\u00e1pida de virus y par\u00e1sitos implicados en la transmisi\u00f3n de enfermedades a trav\u00e9s de los alimentos. Asimismo, se espera que en el futuro pr\u00f3ximo se incremente el uso de los biosensores<\/A> en la industria alimentaria y de los microchips<\/A> para la detecci\u00f3n simult\u00e1nea de varios pat\u00f3genos, as\u00ed como de envases inteligentes<\/A> que alerten a los consumidores sobre la presencia de microorganismos alterantes o pat\u00f3genos en los alimentos. Asistir a pr\u00f3ximas ediciones del curso sobre M\u00e9todos R\u00e1pidos y Automatizaci\u00f3n en Microbiolog\u00eda Alimentaria<\/A> ser\u00e1 sin duda una excelente manera de estar al d\u00eda de los avances que se produzcan en este din\u00e1mico campo.<\/FONT><\/P>

Bibliograf\u00eda<\/SPAN><\/B><\/o:p><\/SPAN><\/FONT><\/P>

  1. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. <\/SPAN>Comprehensive Reviews<\/SPAN><\/I> in Food Science and Food Safety<\/SPAN><\/SPAN><\/I>, 1: 3-22.<\/o:p><\/SPAN><\/FONT>
  2. An\u00f3nimo (2004). Fung\u00b4s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food Safety Magazine<\/I>, agosto-septiembre: 24-31, 60.<\/o:p><\/FONT><\/SPAN>
  3. Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). M\u00e9todos r\u00e1pidos y automatizaci\u00f3n en microbiolog\u00eda alimentaria. <\/SPAN>Alimentaria<\/SPAN><\/I>, mayo 07, 78-80.<\/o:p><\/SPAN><\/FONT>
  4. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San Diego<\/I><\/st1:place><\/st1:City> Business Journal<\/I>. <\/o:p><\/FONT><\/SPAN>
  5. Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free \u201cPop-up\u201d adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology<\/I>, 8(3): 209-217.<\/o:p><\/FONT><\/SPAN>
  6. Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). <\/SPAN>Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food Science,<\/I> 7: 209-213.<\/o:p><\/SPAN><\/FONT><\/LI><\/OL>

    Nota<\/SPAN><\/B>: La informaci\u00f3n contenida en este art\u00edculo se basa en las referencias citadas en la Bibliograf\u00eda<\/st1:PersonName> y en el manual del \u201cVI Workshop sobre M\u00e9todos R\u00e1pidos y Automatizaci\u00f3n en Microbiolog\u00eda Alimentaria\u201d (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007). Los nombres de productos e instrumentos comerciales y empresas se citan \u00fanicamente a t\u00edtulo informativo y no implican en ning\u00fan caso la recomendaci\u00f3n expresa de un producto determinado frente a otros de caracter\u00edsticas similares. <\/o:p><\/SPAN><\/FONT><\/P>

    Carmen Herranz Sorribes
    <\/SPAN><\/B>    Departamento de Nutrici\u00f3n, Bromatolog\u00eda y Tecnolog\u00eda de los Alimentos<\/SPAN><\/A><\/SPAN><\/FONT>
    Facultad de Veterinaria
    Universidad Complutense de Madrid<\/FONT><\/SPAN><\/P>

     <\/P><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

    Los m\u00e9todos r\u00e1pidos y automatizados en microbiolog\u00eda de los alimentos requieren un tiempo reducido para la obtenci\u00f3n de los resultados en comparaci\u00f3n con los m\u00e9todos \u201cconvencionales\u201d, y son f\u00e1ciles de usar, precisos y econ\u00f3micamente rentables. En la primera parte de este blog se describieron las innovaciones introducidas recientemente en los m\u00e9todos empleados para el recuento de las c\u00e9lulas viables y la medici\u00f3n de la biomasa. 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