{"id":131755,"date":"2011-02-06T03:51:08","date_gmt":"2011-02-06T02:51:08","guid":{"rendered":"http:\/\/www.madrimasd.org\/blogs\/biocienciatecnologia\/?p=131755"},"modified":"2011-02-08T14:54:11","modified_gmt":"2011-02-08T13:54:11","slug":"ingenieria-de-proteinas-para-mejorar-la-amplificacion-de-dna","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.madrimasd.org\/blogs\/biocienciatecnologia\/2011\/02\/06\/131755","title":{"rendered":"Ingenier\u00eda de prote\u00ednas para mejorar la amplificaci\u00f3n del DNA"},"content":{"rendered":"

Hoy en d\u00eda numerosos estudios gen\u00f3micos, filogen\u00e9ticos, an\u00e1lisis epidemiol\u00f3gicos, diagn\u00f3stico cl\u00ednico, medicina forense y muchos de los procedimientos de la biolog\u00eda molecular moderna dependen de la amplificaci\u00f3n de cantidades limitantes de DNA, siendo un prerrequisito para un an\u00e1lisis gen\u00f3mico<\/a> exitoso la disponibilidad de herramientas para la amplificaci\u00f3n eficiente de secuencias de \u00e1cidos nucleicos<\/a>.<\/p>\n

Si bien la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR<\/a>) es a\u00fan la metodolog\u00eda m\u00e1s utilizada en la amplificaci\u00f3n de DNA<\/a>, \u00e9sta depende de un conocimiento previo de las secuencias a amplificar, y genera amplicones relativamente peque\u00f1os. Muchos an\u00e1lisis gen\u00f3micos dependen no solo de la longitud del material amplificado, sino tambi\u00e9n de una amplificaci\u00f3n homog\u00e9nea, por lo que son m\u00e1s ventajosas aquellas metodolog\u00edas que permiten la amplificaci\u00f3n eficiente y representativa de genomas completos, siendo la amplificaci\u00f3n isot\u00e9rmica por desplazamiento m\u00faltiple (MDA<\/a>) la que est\u00e1 ganando terreno en el \u00e1rea de la amplificaci\u00f3n de DNA. La MDA se lleva a cabo utilizando oligonucle\u00f3tidos<\/a> hexam\u00e9ricos de secuencia al azar que hibridan en distintas regiones del genoma a amplificar y que son extendidos posteriormente por la DNA polimerasa<\/a> (enzima que sintetiza DNA) del bacteri\u00f3fago \u00f829<\/a>, en una reacci\u00f3n isot\u00e9rmica a 30 \u00baC, sin que se requieran ciclos de desnaturalizaci\u00f3n\/renaturalizaci\u00f3n (a diferencia de la PCR), ni de un conocimiento previo de la secuencia (Figura 1). El \u00e9xito de MDA radica en las caracter\u00edsticas intr\u00ednsecas y espec\u00edficas de la DNA polimerasa de \u00f829:<\/p>\n

1) Capacidad de polimerizar m\u00e1s de 100.000 nucle\u00f3tidos (las unidades que se ensamblan para construir el DNA) sin disociarse del DNA.<\/p>\n

2) Capacidad de atravesar regiones de doble cadena ya que el enzima acopla la s\u00edntesis del DNA a la apertura (desnaturalizaci\u00f3n) de las dos cadenas del DNA, haciendo innecesarios ciclos t\u00e9rmicos de desnaturalizaci\u00f3n.<\/p>\n

3) Elevada fidelidad de s\u00edntesis del DNA (s\u00f3lo un error cada 108<\/sup>-109<\/sup> nucle\u00f3tidos incorporados).<\/p>\n

Esta metodolog\u00eda de amplificaci\u00f3n se ha mostrado muy eficiente como paso previo a la secuenciaci\u00f3n, para la caracterizaci\u00f3n de genomas virales desconocidos, para el genotipado de polimorfismos de nucle\u00f3tido \u00fanico<\/a>, y recientemente para la descripci\u00f3n de nuevos metagenomas<\/a>.<\/p>\n

\"Figura
Figura 1<\/figcaption><\/figure>\n

\u00a0Figura 1.<\/em><\/strong> Amplificaci\u00f3n por desplazamiento m\u00faltiple con la DNA polimerasa de \u00f829. La DNA polimerasa (en esferas naranjas) puede comenzar simult\u00e1neamente la s\u00edntesis del DNA en m\u00faltiples sitios a los que se han hibridado al azar los hex\u00e1meros. Una vez alcanzado el hex\u00e1mero que se encuentra delante, la s\u00edntesis contin\u00faa ya que la polimerasa abre esa regi\u00f3n de cadena doble, dando lugar a \u00abramas\u00bb de cadena sencilla a las cuales se unir\u00e1n nuevos hex\u00e1meros. Esta s\u00edntesis continua del DNA dar\u00e1 lugar a una amplificaci\u00f3n isot\u00e9rmica y exponencial del DNA.<\/em><\/p>\n

\u00a0<\/em><\/p>\n

Puesto que MDA es una alternativa m\u00e1s vers\u00e1til y prometedora que PCR, el principal reto era la construcci\u00f3n de variantes de la DNA polimerasa de \u00f829 a\u00fan m\u00e1s eficientes en\u00a0 amplificaci\u00f3n de DNA. Debido a la complejidad estructural de las DNA polimerasas y a sus m\u00faltiples interacciones con los sustratos, la adquisici\u00f3n de nuevas propiedades requiere de grandes modificaciones estructurales, tarea dif\u00edcil de abordar con mutaciones puntuales dirigidas a amino\u00e1cidos espec\u00edficos. De hecho, hasta la fecha, las \u00fanicas mejoras en MDA se hab\u00edan conseguido explorando diferentes modificaciones t\u00e9cnicas de los protocolos actuales.<\/p>\n

En el trabajo publicado recientemente en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of <\/em>USA<\/a> los doctores Miguel de Vega y Margarita Salas, del Centro de Biolog\u00eda Molecular Severo Ochoa<\/a> (CSIC-UAM), se plantearon como objetivo conseguir variantes de la DNA polimerasa de \u00f829 que mostraran m\u00e1s afinidad por el DNA a amplificar que el enzima no modificado con el fin de aumentar la eficiencia de amplificaci\u00f3n. Mediante t\u00e9cnicas de ingenier\u00eda de prote\u00ednas fusionaron al extremo C-terminal de la DNA polimerasa de \u00f829 dominios de uni\u00f3n inespec\u00edfica al DNA (Helix-hairpin-Helix; HhH) (Figura 2). Las DNA polimerasas quim\u00e9ricas resultantes mostraron un incremento, respecto al enzima natural, en la capacidad de utilizaci\u00f3n de los hex\u00e1meros iniciadores,\u00a0 implicando una mayor eficiencia de amplificaci\u00f3n (v\u00eda MDA) de cantidades limitantes de DNA, tanto circular como gen\u00f3mico lineal, lo que representa una mejora sustancial en los protocolos de amplificaci\u00f3n. Estas variantes de la DNA polimerasa de \u00f829 tienen aplicaciones potenciales en an\u00e1lisis gen\u00f3micos, como estudios cl\u00ednicos, forenses y antropol\u00f3gicos en los que las cantidades muy limitantes de DNA suponen una barrera para su amplificaci\u00f3n y posterior estudio. Adem\u00e1s, la alta fidelidad de inserci\u00f3n de nucle\u00f3tidos y elevada procesividad de estas quimeras hace que puedan ser \u00fatiles en las tecnolog\u00edas de secuenciaci\u00f3n de tercera generaci\u00f3n que actualmente se est\u00e1n desarrollando. La combinaci\u00f3n de las DNA polimerasas quim\u00e9ricas con la optimizaci\u00f3n de los protocolos\u00a0 de reacci\u00f3n actuales contribuir\u00e1n a hacer de las tecnolog\u00edas de amplificaci\u00f3n basadas en la DNA polimerasa de \u00f829 una de las herramientas m\u00e1s potentes en gen\u00f3mica.<\/p>\n

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\"Figura<\/dt>\n
Figura 2<\/dd>\n<\/dl>\n

Figura 2.<\/em><\/strong> Modelado de las DNA polimerasas quim\u00e9ricas construidas. La figura representa el modelo estructural de un dominio (HhH)2<\/sub> (en azul claro) unido a trav\u00e9s de un p\u00e9ptido de uni\u00f3n al extremo C-terminal de la DNA polimerasa de \u00f829 (en morado)<\/em>El inter\u00e9s biotecnol\u00f3gico de estas variantes creadas por ingenier\u00eda de prote\u00ednas ha quedado refrendado por la reciente concesi\u00f3n de la licencia de explotaci\u00f3n de estas polimerasas por parte del CSIC<\/a> a la empresa espa\u00f1ola de biotecnolog\u00eda XPol Biotech, SL<\/a> para su pronta puesta en el mercado.<\/p>\n

\u00a0<\/p><\/div>\n

Este trabajo ha merecido una rese\u00f1a en la revista Science-Business eXchange<\/a>, del grupo Nature.<\/p>\n

CBMSO<\/a><\/p>\n

\u00a0<\/embed><\/object><\/p>\n

DIVULGACI\u00d3N CIENT\u00cdFICA A\u00a07 DE\u00a0FEBRERO DE\u00a02011<\/a><\/strong><\/p>\n

\u00a0MADRI+D TV<\/a> (Divulgaci\u00f3n cient\u00edfica con cara, e im\u00e1genes, en 3 minutos)<\/p>\n

ENTRE PROBETAS<\/a> (P\u00edldoras cient\u00edficas en 2 minutos). Radio 5<\/p>\n

A HOMBROS DE GIGANTES<\/a> Radio 5<\/p>\n

\u00a0FACEBOOK<\/a>\u00a0(Jos\u00e9 Antonio L\u00f3pez-Guerrero)<\/p>\n

TWITTER<\/a> (JALGUERRERO)<\/p>\n

LINKED-IN <\/a>(Jal Guerrero)<\/p>\n

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