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16/10/2012  
El uso de transposones en la investigación del cáncer

La investigación del cáncer está sufriendo en los últimos años un cambio espectacular. El uso de nuevas tecnologías, como la secuenciación masiva, está permitiendo caracterizar de manera mucho más profunda lo que pasa dentro de los tumores. Uno de los nuevos sistemas que está siendo utilizado para identificar genes implicados en cáncer consiste en la utilización de transposones especialmente modificados para tal fin.


Manuel Navarro
Departamento de Oncología Molecular CIEMAT



En los últimos meses, varios grupos, incluyendo el nuestro en la Unidad de Oncología Molecular del CIEMAT (Madrid), han presentado artículos en los que se utilizan transposones para lograr la identificación de genes implicados en diferentes tipos de tumores. Este artículo tiene como fin divulgar en qué consiste la tecnología de transposones y discutir sus ventajas en el estudio del cáncer.

Un tumor se origina porque una célula del cuerpo sufre mutaciones en uno o varios genes. Estas mutaciones inactivan los mecanismos de control de crecimiento de la célula y permiten que se divida sin freno. Dado que la causa del cáncer es siempre la desregulación del programa de expresión génica, la investigación biológica del cáncer está basada en gran medida en la identificación de los genes que están mutados en los tumores, como pista principal para poder diseñar o desarrollar luego tratamientos adecuados.

Corte de piel de ratón transgénico en el cual se ve la expresión de la transposasa  en numerosas células de la piel

Las mutaciones en genes pueden causar cáncer por dos mecanismos principales, que se podrían llamar de acción u omisión. En el mecanismo de “omisión” (genes supresores tumorales), las mutaciones generalmente inactivan o disminuyen la expresión de genes necesarios para frenar o evitar el crecimiento tumoral. En el mecanismo de “acción” (oncogenes), las mutaciones resultan en la expresión o actividad incrementada de genes que favorecen el cáncer.

Históricamente se han desarrollado varias aproximaciones para identificar qué genes causan tumores al ser mutados. Las más clásicas son los intentos de mutagénesis generalizada con radiaciones o agentes químicos, como la ENU (N-etil-N-nitrosourea), un potente mutágeno que es capaz de producir mutaciones puntuales en el ADN. La idea era saturar de mutaciones con ENU los espermatozoides de los animales modelo, ponerlos a cruzar, buscar tumores en la descendencia, y luego, por complejas tecnologías genéticas y retrocruces, intentar identificar los genes mutados. De esta manera se consiguió encontrar un cierto número de genes, si bien el trabajo a realizar para localizar la mutación es abrumador. De la importancia de este método habla el hecho de que aún se sigue usando, incluso en proyectos a gran escala.

Un sistema más reciente y aparentemente más conveniente es la mutagénesis insercional con retrovirus. Para esta aproximación se infecta el organismo con retrovirus, que se integran en el genoma. Estos retrovirus suelen estar modificados de tal forma que no puedan producir nuevas partículas infecciosas, pero allí donde se integran originan una mutación. Algunas de estas mutaciones darán lugar a tumores. Después, de nuevo hay que identificar dónde está la mutación –dónde está integrado el virus- pero ahora ya es más fácil, pues se pueden incluir en el retrovirus secuencias específicas que permitan su identificación (lo que no era posible con el sistema anterior, mediante agentes químicos). Esta aproximación es muy prometedora, pero tiene algunos inconvenientes: los virus infectan preferentemente a algunos tipos de células (como los linfocitos), por lo que no todos los cánceres pueden ser estudiados. Además, estos retrovirus tienen tendencia a integrarse en ciertos lugares del genoma y en general una célula que ya ha sido infectada por un virus no puede ser infectada de nuevo, por lo que el número de mutaciones producidas en cada célula no es muy alto. Aún así, la técnica ha dado interesantes resultados. Una aproximación similar se realiza con transposones, que además ofrecen otras ventajas.

Las nuevas tecnologías de análisis masivo están permitiendo ya cosas hasta hace poco impensables. La determinación a pie de cama de los genes mutados en el tumor de un determinado paciente permitirá aplicarle un tratamiento personalizado

Los transposones son pequeños fragmentos de ADN que tienen la capacidad de moverse autónomamente dentro del genoma, esto es, son capaces de “saltar” de su localización e integrarse en un lugar distinto, dentro del mismo o diferente cromosoma. En los años 50 del siglo pasado, Barbara McClintock descubrió la transposición en maíz. Aunque sus hallazgos fueron inicialmente recibidos con escepticismo e incluso con hostilidad, en los años 70 se “redescubrieron” y McClintock recibió el crédito que merecía, incluyendo la concesión del premio Nobel en 1983. Desde entonces, los transposones han sido ampliamente utilizados en la investigación en plantas, bacterias e incluso en la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster. No se ha podido ir más allá, sin embargo, dado que no existen transposones activos en vertebrados. En efecto, los transposones, como elementos integrativos que son, son capaces de causar numerosas mutaciones en una célula, así que hace ya millones de años que los antepasados de los actuales vertebrados desarrollaron métodos para mantenerlos a raya. No obstante, se calcula que aproximadamente la mitad de nuestro genoma proviene de antiguos transposones inactivados de todo tipo.

Hay dos tipos de transposones, los de RNA, llamados “copia y pega”, y los de DNA, o de “corta y pega”. Estos últimos, que son los que nos atañen, constan de una secuencia repetida en los extremos, y en medio una secuencia que codifica para una proteína, la transposasa. Esta transposasa, una vez trascrita y traducida por la maquinaria celular, se une a las secuencias repetidas de ADN del extremo del transposón y lo escinde del resto del genoma, reintegrándolo posteriormente en otra zona, cercana o lejana. De esta manera, el número de copias del transposón permanece en principio constante en una célula dada.

Numerosos tumores generados en la piel de un ratón transgénico tras varios meses de expresar el transposón

A mediados de la década de los 90 del siglo pasado, Zsuzsanna Izsvák y Zoltán Ivics, en el laboratorio de Perry Hackett en Minnesota, tuvieron la idea de “reactivar” un antiguo transposón fósil de salmón, para utilizarlo como herramienta genética. Para ello, compararon su secuencia con la de varios transposones activos en otras especies y “deshicieron” las mutaciones inactivantes que había recibido a lo largo del proceso evolutivo de los vertebrados. Aunque su objetivo inicial era producir “supersalmones” para la pesca deportiva, pronto vieron que el sistema podía servir para mucho más. A este transposón, “despertado” tras muchos millones de años dormido, le llamaron “bella durmiente” (Sleeping Beauty)

En 2005, Adam Dupuy, también en Minnesota, modificó el transposón para convertirlo en un agente mutagénico. La transposasa se separó, y en el hueco de secuencia que dejaba libre se introdujo una estructura génica diseñada para causar mutaciones allá donde cayese. Para tal fin, incluía señales de fin de lectura en ambos sentidos, para detener la transcripción de los genes en los que se integrase; así como un promotor para inducir la transcripción de los genes (incluso si estos estuviesen incompletos) a partir del punto en que se integrase. De este modo, si el transposón “salta” en un gen activo, lo inactivaría, y si saltase en la orientación correcta en un gen inactivo, lo activaría en todo o en parte. Así se consigue que el transposón cause mutaciones tanto en oncogenes como en genes supresores tumorales.

Y esta es precisamente la tecnología que hemos utilizado en la Unidad de Oncología Molecular del CIEMAT (1). La secuencia de la transposasa se ha separado del transposón y se ha puesto bajo el control de un promotor específico de piel (promotor del gen de la queratina K5). Hemos hecho ratones transgénicos con esta construcción, que expresan transposasa en la piel (lo cual en si mismo no tiene ningún efecto). Cuando estos animales se han cruzado con otros llevando varias copias del transposón mutagénico, los animales dobles transgénicos han activado el movimiento del transposón sólo en células de la piel. Con el tiempo, estos animales desarrollan tumores de piel. ¿Como sucede esto?

Según este sistema, la transposasa que se está expresando durante toda la vida del ratón (el promotor K5 es activo desde que empieza a formarse la piel en el día E13.5 del desarrollo embrionario, hasta la muerte del animal) produce el salto continuo del transposón. Este salto se produce “al azar” (el transposón no tiene predilección por ninguna secuencia, y solo necesita un dinucleótido TA para integrarse) y con una determinada frecuencia. Dado que estos ratones tienen del orden de 100-300 copias del transposón, tras algunas semanas cada célula de la piel tendrá su particular colección de integraciones en genes, que se supone irá variando en el tiempo.

Pero, en algunos casos, y de manera totalmente aleatoria, estos transposones móviles habrán caído (y por tanto mutado) en uno o varios genes que, individualmente o de manera combinada, sean capaces de causar un tumor. Esta combinación de integraciones se selecciona positivamente. ¿Por qué? porque en el momento en que el transposón salta de nuevo fuera de los genes tumorigénicos, la célula pierde la capacidad tumoral y por tanto deja de dividirse sin control. Así pues, cada tumor tendrá una combinación específica de inserciones del transposón, una o varias de las cuales serán responsables del desarrollo del tumor.

Uno de los genes que frecuentemente se mutan y no se expresan en los tumores de ratón es Nsd1. Aquí se ve que en un tumor de piel humano también se pierde la expresion de Nsd1 en el tumor, mientras que sí existe en la piel.

Una vez obtenidos los tumores, es necesario identificar todos los sitios donde se ha integrado el transposón en cada uno de ellos. Dado que la secuencia del transposón es previamente conocida, utilizando técnicas especiales de PCR se pueden amplificar moléculas híbridas que incluyen un extremo del transposón y el fragmento del genoma del ratón adyacente, donde se ha producido la integración. Una vez amplificadas estas moléculas por PCR, se utilizan las técnicas de secuenciación masiva para determinar la secuencia de ADN de cada fragmento. Si el proceso se ha realizado de forma eficiente, se pueden identificar la mayor parte de las integraciones de cada tumor. Secuenciar de esta manera casi 100 tumores de ratón es una hazaña que hace muy pocos años no se podía ni siquiera soñar. Ahora, gracias al increíble avance de las tecnologías genómicas, se puede hacer en poco tiempo y con un coste asumible (al menos antes del desastre actual).

Pero, ¿como diferenciar aquellos genes que son importantes para el desarrollo del tumor de aquellos que, sin serlo, se encuentran también mutados en el tumor como resultado de integraciones pasajeras de otras copias del transposón? Pues la única manera es una aproximación estadística: es muy improbable que dos tumores distintos tengan integraciones en el mismo gen por casualidad, así que aquellos genes que tengan el transposón integrado en ellos en varios tumores diferentes, probablemente serán importantes para el desarrollo del tumor. Así pues, una vez analizado un número relativamente elevado de tumores, se cuantifica la probabilidad de cada uno de los genes identificados de recibir un transposón al azar, y se compara con el número de inserciones encontradas. De esta manera pudimos identificar, en nuestro caso particular, 126 genes implicados en el desarrollo de los tumores de piel (1).

Pero estos resultados se refieren a los tumores de ratón. Aunque la piel del ratón y la del hombre son biológicamente muy similares, existen diferencias entre ellas. En cuanto al cáncer de piel, que es lo que nos atañe, la piel del ratón está totalmente recubierta de pelo y además éste es un animal nocturno, por lo cual se podría pensar que el ser humano -predominantemente diurno- podría haber desarrollado mecanismos de defensa específicos para evitar el cáncer de piel, que en su mayoría está causado por exposición a la radiación solar. Además, y entre otras diferencias biológicas en las que no vamos a entrar, la piel del ratón es mucho más fina y está “diseñada” para durar unos pocos años, no los alrededor de 100 que podemos vivir nosotros.

Así pues, sea en piel o en cualquier otro tejido, es imprescindible confirmar en muestras humanas los resultados obtenidos en el ratón. Para ello, hay dos aproximaciones: por un lado, se debe identificar físicamente que estos genes están mutados o su expresión está alterada en tumores humanos. Hacer esto no siempre es fácil, pues bastantes de estos genes son relativamente desconocidos y no existen anticuerpos ni reactivos apropiados para trabajar con ellos. Afortunadamente, existe la segunda opción: utilizar la información genómica disponible actualmente en la web para identificar mutaciones en estos genes ya detectadas por otros grupos. Este aspecto es extremadamente útil: existe cada vez más información disponible en la web sobre los resultados de la secuenciación de numerosos tumores, donde uno puede ver el estado de los genes que le interesen en particular. Utilizando estos sistemas, tanto nosotros con el cáncer de piel como otros grupos con otros tumores, hemos conseguido validar un número significativo de genes obtenidos en experimentos con ratones en tumores humanos, demostrando la fuerza de la aproximación experimental.

Las nuevas tecnologías de análisis masivo están permitiendo ya cosas hasta hace poco impensables. La determinación a pie de cama de los genes mutados en el tumor de un determinado paciente permitirá aplicarle un tratamiento personalizado. Sin embargo, para que esto ocurra es necesario antes utilizar estas nuevas tecnologías (y las no tan nuevas) para caracterizar de manera exhaustiva los diferentes tipos de tumores y ensayar la respuesta de éstos a los tratamientos elegidos de una manera razonada. Pero para desarrollar estos tratamientos será necesario también caracterizar en profundidad las rutas bioquímicas en las que están implicadas las proteínas codificadas por los genes mutados. Es todavía un trabajo de largos años el que nos espera para conseguir una curación generalizada del cáncer, pero indudablemente estamos en el buen camino, y los transposones están siendo útiles para dar algunos de los más recientes pasos.



(1): Quintana R, Dupuy AJ, Alameda JP, Casanova L, Bravo A, Page A, Sanchez-Viera M, Ramirez A and Navarro M (2012). A transposon-based analysis of gene mutations related to skin cancer development. J. Invest. Dermatol advance online publication, July 26, 2012; doi:10.1038/jid.2012.245.



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