Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria (yII)

Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos requieren un tiempo reducido para la obtención de los resultados en comparación con los métodos “convencionales”, y son fáciles de usar, precisos y económicamente rentables. En la primera parte de este blog se describieron las innovaciones introducidas recientemente en los métodos empleados para el recuento de las células viables y la medición de la biomasa. En esta segunda parte, se tratan las referidas a los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, y a los métodos inmunológicos y genéticos.

Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico

Los sistemas miniaturizados surgen a partir del concepto de la placa microtituladora (96 pocillos, formato 8×12), que permite reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos, así como estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran número de aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado. Esta línea de investigación ha permitido desarrollar algunos de los medios de cultivo selectivos que se encuentran en el mercado actualmente. Entre los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas (O.B.I.S., Oxoid); galerías que permiten la identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras (API, bioMérieux); tubos de plástico con compartimentos que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube, BD); y soportes plásticos con pocillos de fácil inoculación que contienen sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal, BD; RapID systems y MicroID, Remel; Biochemical ID systems, Microgen).

Dr. Fung

El Dr. Fung, pionero de la miniaturización en microbiología de los alimentos

Uno de los sistemas miniaturizados y automatizados más conocidos y sofisticados es el sistema VITEK (bioMérieux) que, basándose en cambios de color de los sustratos o en la producción de gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta plástica que contiene los sustratos bioquímicos en forma deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en 2-4 h. Una rapidez similar en la obtención de resultados puede obtenerse con el sistema Biolog (AES Chemunex) que detecta la capacidad de los microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono. Los 295 (4×1028) patrones metabólicos posibles permiten, además de la identificación, el establecimiento de relaciones filogenéticas entre distintos aislados. El empleo de un único cromógeno como indicador rédox, el violeta de tetrazolio, que se reduce de forma irreversible a formazán (color violeta) como consecuencia de la actividad metabólica bacteriana, facilita la lectura visual de los resultados. En cualquier caso, la mayoría de los sistemas citados en esta sección ofrecen la posibilidad de lectura e interpretación de resultados de manera automática.

Métodos Inmunológicos

Los métodos inmunológicos se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo policlonal o monoclonal. En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más empleado para la detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo sándwich. En los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la detección de Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas estafilocócicas (Assurance EIA y TRANSIA PLATE, Biocontrol; TECRA VIA, Biotrace International; Salmonella UNIQUE, Tecra; Detex, Molecular Circuitry Inc.). Un número considerable de laboratorios de microbiología de los alimentos emplea instrumentos automatizados basados en una variante de la tecnología ELISA conocida como ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacción es fluorescente en lugar de cromogénico, para la detección de los patógenos alimentarios mencionados (VIDAS, bioMérieux).

Métodos Inmunológicos

La separación inmunomagnética (1) emplea partículas paramagnéticas recubiertas de anticuerpos específicos. Puede utilizarse para separar y concentrar los microorganismos presentes en los alimentos antes de realizar un ELISA (2)

En ocasiones, se utiliza la técnica de separación inmunomagnética (SIM), que emplea partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos (Dynabeads, Dynal), para concentrar el antígeno de interés como etapa previa a la realización del ELISA. La SIM permite reducir el tiempo requerido para el enriquecimiento de la muestra, así como obtener suspensiones que contienen menor cantidad de partículas del alimento, lo que facilita su procesado posterior mediante distintas técnicas (hibridación con sondas génicas, PCR, etc.). Para laboratorios con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits de diagnóstico basados en el principio de la inmunocromatografía de flujo lateral caracterizados por ser rápidos, sencillos y no requerir instrumentación especial (VIP, Biocontrol; Reveal, Neogen; RapidChek, Strategic Diagnostics). Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y listos para usar son los basados en la inmunodifusión en un vial de agar para la detección rápida de serovares mótiles de Salmonella (1-2 Test, Biocontrol) o en la aglutinación reversa pasiva con partículas de látex para la detección de microorganismos patógenos (Microscreen, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA kits, Oxoid).

Métodos Genéticos

A diferencia de los métodos citados en las secciones anteriores, que detectan características fenotípicas sujetas de manera natural a variación, los métodos genéticos se dirigen a la detección de características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos nucleicos. Una técnica para detectar dichas características en ausencia de instrumentación especializada es la hibridación de ácidos nucleicos. Los ensayos comerciales actuales emplean sondas genéticas (oligonucleótidos sintéticos) marcadas enzimáticamente que, tras hibridar con regiones específicas del ARN ribosómico (una célula bacteriana puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una única copia de ADN cromosómico), catalizan una reacción que da lugar a un producto coloreado a partir de un sustrato cromogénico, lo que es indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento (GeneQuence, Neogen). En los últimos años es cada vez más frecuente en los laboratorios de microbiología de los alimentos el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer así de una cantidad suficiente que permita su detección. Se trata de una técnica específica, sensible (en teoría, puede detectar una única copia del ADN diana en el alimento; en la práctica se necesitan unas 103 ufc/ml para una detección reproducible) y rápida, a lo que contribuye el desarrollo de metodologías alternativas de detección de los productos de PCR que evitan el procesamiento post-reacción. Dichas metodologías están basadas en el empleo de agentes intercalantes (por ejemplo, SYBR Green) o sondas específicas con doble marcaje fluorescente que, además de posibilitar la “visualización” del progreso de la reacción, facilitan la automatización del proceso y permiten la cuantificación de la cantidad de DNA diana presente inicialmente en la muestra (PCR cuantitativo en tiempo real).

PCR cuantitativo en tiempo real

La técnica de PCR cuantitativo en tiempo real puede emplearse para la detección y cuantificación de: (1) microorganismos patógenos en los alimentos; (2) alimentos modificados genéticamente; (3) fraude por sustitución de especies en productos de elevado valor comercial

A pesar de tratarse de una técnica sofisticada, el empleo de la técnica de PCR en tiempo real en el laboratorio de microbiología de los alimentos se está viendo facilitado en los últimos años por el desarrollo de sistemas para la detección de patógenos de los alimentos que son fáciles de utilizar, requieren una manipulación mínima y reducen la necesidad de interpretación de los resultados (BAX Q7, Du Pont Qualicon; iQ-Check, Bio-Rad; TaqMan Pathogen Detection Kits, Applied Biosystems; Roche/Biotecon Diagnostics LightCycler, Roche; Warnex, AES Chemunex). La técnica de PCR cuantitativo en tiempo real es una de las opciones más prometedoras en los laboratorios de control de calidad de los alimentos, no solo para la identificación y cuantificación de microorganismos, sino también para la determinación de la presencia de organismos modificados genéticamente en materias primas y productos terminados y para la autentificación de productos en los que pueda producirse un fraude por sustitución de especies por otras de menor valor comercial.

La investigación epidemiológica de brotes alimentarios y la monitorización rutinaria de microorganismos en el ambiente requiere sistemas que sean capaces de identificar los microorganismos más allá del nivel de especie. Para ello, partiendo de una colonia de cultivo puro, pueden emplearse procedimientos automatizados basados en la hibridación de sondas específicas con fragmentos de restricción del ADN (Riboprinter, DuPont Qualicon) o técnicas más difícilmente automatizables y que requieren analistas cualificados para su realización e interpetación (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE; MultiLocus Sequence Typing, MLST).

Sumario y perspectivas

Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos representan un área de la microbiología aplicada en continua expansión. La rapidez en la obtención de resultados es esencial en la industria alimentaria para reducir los tiempos de espera en los procesos de producción y liberar más rápidamente los lotes producidos. Además, la rapidez es fundamental en un programa de APPCC exitoso, ya que permite la aplicación de acciones correctoras durante el procesado de los alimentos. El tiempo ahorrado mediante el empleo de estos métodos puede utilizarse para otras tareas tales como revisar el plan de APPCC, ampliar los planes de control de patógenos y de análisis químicos (micotoxinas, antibióticos, alérgenos, etc.), formar a los empleados en los riesgos microbiológicos, etc.

Aunque en la actualidad la mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de bacterias, es previsible que se desarrollen nuevos métodos para la identificación rápida de virus y parásitos implicados en la transmisión de enfermedades a través de los alimentos. Asimismo, se espera que en el futuro próximo se incremente el uso de los biosensores en la industria alimentaria y de los microchips para la detección simultánea de varios patógenos, así como de envases inteligentes que alerten a los consumidores sobre la presencia de microorganismos alterantes o patógenos en los alimentos. Asistir a próximas ediciones del curso sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria será sin duda una excelente manera de estar al día de los avances que se produzcan en este dinámico campo.

Bibliografía

  1. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1: 3-22.
  2. Anónimo (2004). Fung´s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food Safety Magazine, agosto-septiembre: 24-31, 60.
  3. Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria. Alimentaria, mayo 07, 78-80.
  4. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San Diego Business Journal.
  5. Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free “Pop-up” adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
  6. Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food Science, 7: 209-213.

Nota: La información contenida en este artículo se basa en las referencias citadas en la Bibliografía y en el manual del “VI Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria” (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007). Los nombres de productos e instrumentos comerciales y empresas se citan únicamente a título informativo y no implican en ningún caso la recomendación expresa de un producto determinado frente a otros de características similares.

Carmen Herranz Sorribes
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos

Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid

 

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Comentarios

informaciones muy importante, al respecto por favor enviarnos información o documentacón sobre DETECCION Y CUANTIFICACION DE BACTERIAS PATOGENICAS EN ALIMENTOS POR PCR, agradeceremos por la valiosa informacón

atentamente

roger

hola buen dia, estoy interesa en saber los precios de las bioquimicas en el sistema miniaturizados, por favor, les agradeciea sus respuestas

Hola:

Este material es muy bueno y les agradecería si me pudiesen enviar más información sobre las nuevas técnicas rápidas de control microbiológico.

De antemano, muchas gracias.

Bueno dias!! estamos muy interesados en conocer sobre alternativas rapidas de dterminacion de salmonella (kit)

Agradeceria si pudiera mandarnos la informacion de la empresa con quien podamos contactar.

Estoy interesados en los métodos de diagnostico rápido, desearía, más detalle informativo y precios. muchas gracias

Muy buenas tardes el articulo esta muy interesante, me gustaria saber si este metodo se puede usar para todo tipo de productos de consumo humano en mi caso serian para el agua, y si es asi por favor le agradeceria me envie alguna cotizacion y deas infromacion necesaria para la implementacion de este metodo.

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