Coronavirus: CoVid19. ¿Qué es la PCR? ¿Cómo se usa para detectar si estamos infectados por el virus SARS Cov 2?

PCR son las siglas del nombre en inglés de una técnica que usamos de manera rutinaria los laboratorios de investigación de todo el mundo: Polymerase Chain Reaction. Que en español se traduce como Reacción en cadena de la polimerasa

Es una técnica muy empleada en Biología Molecular y se usa para amplificar un segmento (fragmento, zona) de ADN.  El ADN (ácido desoxirribonucleico) es nuestro material genético. El diccionario de lo que somos. Está en el núcleo de nuestras células. Está formado por dos cadenas entrelazadas formando la típica doble hélice que conoce todo el mundo:

Cada una de estas cadenas está formada por una secuencia de nucleótidos que son como las piezas que se unen y forman estas cadenas. Cada nucleótido está formado por varios componentes (un monosacárido, un grupo fosfato y una base nitrogenada). Hay 4 bases nitrogenadas: adenina (A), guanina (G),  timina (T), citosina (C).

La secuencia de estas letras tiene un significado porque contienen la información para que se puedan formar proteínas necesarias para las células de nuestro cuerpo.

Una secuencia de ADN podría ser: cacagacaca gaaaccgccg ttgtcaacgt cacatatgca acaagagaag aagcaaaaat

Aunque parezca que son letras al azar y sin sentido, no es verdad. Existe un código que permite que en el interior de nuestras células se produzca el desencriptado. Y por tanto esas letras contienen nuestra información genética.

Esa información genética se guarda en el núcleo de las células, que es donde está el ADN y sirve para que se formen proteínas. ¿Cómo se forman? Las dos cadenas del ADN se abren y se realiza una copia de la secuencia. Así se forma el ARN, que es como el mensajero que lleva la información exacta al citoplasma de la célula donde, con la información que ha copiado y con el código del que hablábamos antes, se produzcan las proteínas (cada 3 letras de ADN codifican un aminoácido que es la pieza de la que están formadas las proteínas). Pero el ARN no es una copia exacta del ADN porque la timina (T) se sustituye por un uracilo (U) y el azúcar se cambia.

Esto es muy importante porque algunos virus no tienen ADN como ácido nucleico sino que tienen ARN. Es el caso de Sars-Cov-2. Y es muy importante porque como dijimos al principio la PCR es una técnica que se usa para amplificar un segmento de ADN. Solo funciona con ADN, con las 4 letras del ADN: A,C,T,G. Entonces si quisiésemos detectar el Sars-Cov-2, tendríamos que hacer algo con su ARN para poder amplificarlo. Y lo hacemos, claro que sí!!

Hacemos la transcripción reversa o retrotranscripción con la que somos capaces de generar una cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) que llamamos ADN complementario (ADNc) a partir de ARN. Y lo hacemos gracias a una enzima, la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa, que los científicos descubrieron hace años a partir de algunos virus.

Este proceso explica las letras RT (retrotranscripción) que se ponen antes de la PCR, para indicar que debemos transformar el RNA del virus en cDNA para poder amplificarlo.

Y ahora sí. Ya tenemos el ADN o el cDNA (ADN complementario).  Pero una cadena de ADN o de ARN es muy difícil de detectar. Tenemos que “amplificarla” o sea producir muchísimas copias para poder trabajar con él e incluso para poder decir si está o no está un virus por ejemplo en nuestra muestra.

¿Cómo se realiza esa amplificación del genoma viral del coronavirus mediante PCR?

Gracias a otra enzima, la ADN polimerasa. Es una enzima que copia las “letras” de la cadena de ADN ayudándose de una señal, que es una secuencia corta de nucleótidos (una frase corta de letras), que se une al ADN y le indica a la polimerasa donde tiene que empezar a copiar. Si nosotros conocemos la secuencia de lo que queremos detectar, diseñamos dos señales o “primers” al principio y al final de la secuencia “diana”. Así le enseñamos a la polimerasa que es lo que tiene que copiar empleando los “ladrillos o nucleótidos” que también le tenemos que proporcionar. Y empieza la reacción:

-Calentamos la muestra a 95ºC. Así las hebras de ADN se abren (desnaturalización)

– Enfriamos la muestra a unos 55-60 ºC: así nuestros primers se unen a la secuencia diana. En nuestro caso del coronavirus, se unirían a las secuencias del virus si es que está presente en nuestra muestra. Es el alineamiento.

-Y ahora calentamos a 72ºC que es la temperatura adecuada para que nuestra polimerasa copie la secuencia empezando en las señales que le hemos indicado (primers). Esto se conoce como Extensión.

Cada una de estas 3 fases dura solo segundos o minutos. En cada ciclo se llevan a cabo estos 3 pasos y eso significa que si la secuencia diana está en nuestra muestra, en cada ciclo se duplica la cantidad de ADN. Y este ciclo dura menos de 10 minutos. Empleamos unas máquinas que producen los cambios de temperatura de forma rápida y que se llaman termocicladores

Pasamos  de 2 copias a 4 y de ahí a 8, a 16, a 32, a 64, a 128….

Si lo repetimos 20, 30 o 40 veces amplificaremos la secuencia diana de ADN millones de veces. Y con esto ya podemos trabajar!! Si se ha producido la amplificación es que la secuencia diana estaba en nuestra muestra.

En el caso de COVID19, la muestra se extrae de los pacientes supuestamente infectados con un hisopo a partir de nariz y garganta. Es muy importante que la toma de muestras sea adecuada. Si el virus no está en la muestra, la PCR no puede detectarlo.

Después llevamos la muestra a un laboratorio, extraemos el RNA (donde supuestamente está el del coronavirus), realizamos el paso de retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA y lo amplificamos en un termociclador mediante PCR. Si estaba el virus en la muestra, aunque fuese en muy poca cantidad, lo habremos amplificado suficientemente como para detectarlo y podremos decir que la muestra era positiva. Todo este proceso desde la toma de muestras puede tardar unas 4 horas.

Si sale positivo, significa que en nuestra muestra había alguna copia de ARN del coronavirus. La variante de PCR que empleamos va a ser capaz incluso de indicarnos cuanto virus había en la muestra, o sea que podremos tener una referencia de la carga viral que tenía el paciente.

En otros post veremos otras técnicas indirectas de detección del virus.

Video sobre la PCR

[youtube]https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU[/youtube]