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Cómo el primer virus descubierto por la ciencia puede contribuir a luchar frente al SARS-CoV2

¿Sabían que el primer virus descubierto por la ciencia puede ayudar a combatir al recién llegado SARS-COV2, y que las plantas pueden hacer más accesible el diagnóstico de COVID19? Si alguna de estas cuestiones les intriga, les recomiendo que sigan leyendo.

Todo el mundo ya conoce la utilidad de los tests de diagnóstico de COVID19. Unos detectan directamente los componentes del virus: p.ej genoma (PCR), o antígenos (Ag) (tests de Ag) y otros detectan anticuerpos (Ac). La importancia de estos tests para controlar los contagios ha quedado muy clara durante la pandemia. Saber si alguien ha sido infectado para, mediante el aislamiento, prevenir contagios se ha convertido en la estrategia básica de control, junto con la vacunación. Los test de detección de anticuerpos son útiles en cribados serológicos, para conocer el estatus inmunológico de la población, estimar su grado de protección frente a la infección, etc. A nivel individual pueden ayudar a establecer un juicio clínico en pacientes COVID19.

Para detectar anticuerpos frente al SARS-COV2 es necesario disponer de un antígeno derivado del virus. Un antígeno es una molécula distintiva del virus a la cual se unen los anticuerpos que intervienen en la respuesta inmune frente a la infección. Los antígenos más útiles y por tanto más empleados en el diagnóstico de COVID19 son los derivados de la proteína S (espícula) y de la N (nucleocápsida). Numerosos test se basan en la utilización de estas dos proteínas, completas o diferentes fragmentos derivados de ellas.

La tecnología del ADN recombinante permite obtener versiones de estas proteínas (versiones “recombinantes”) utilizando sistemas heterólogos, independientes del virus que originalmente las produce. P. ej, se pueden utilizar bacterias, levaduras, células de insecto, de mamífero, etc. La ventaja más importante de estos sistemas es que permiten el cultivo a gran escala. Además, lo hacen independiente de la producción de virus in vitro, un procedimiento que plantea serios riesgos de bioseguridad. De este modo es posible obtener cantidades de antígenos a escala industrial, apropiada para las aplicaciones diagnósticas mencionadas. Un interesante sistema heterólogo de expresión de proteínas recombinantes lo constituyen las plantas. Éstas presentan ciertas ventajas respecto a los sistemas ya mencionados, como p. ej. su fácil escalado, lo que abarata la producción considerablemente.

Hace unos meses nuestro grupo en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) del INIA-CSIC comenzó una colaboración con biotecnólogos del Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), también del INIA-CSIC, y de la empresa biotecnológica AGRENVEC,  que ha terminado felizmente en la publicación de un artículo en Frontiers in Plant Science. El artículo describe cómo se ha logrado expresar y producir, a escala industrial, una parte (mitad C-terminal) de la proteína N del SARS-CoV2 en plantas de Nicotiana benthamiana, una especie muy empleada como biofactoría, del mismo género que la planta del tabaco.

Portada del artículo: “The C-Terminal Half of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein, Industrially Produced in Plants, Is Valid as Antigen in COVID-19 Serological Tests” publicado en Frontiers in Plant Science el 27 de julio.

 

Es aquí donde el primer virus descubierto por la ciencia, el virus del mosaico del tabaco o TMV (Beijerinck, 1892) viene a echar una mano. Empleamos este virus como “vector” o vehículo para promover la expresión de la proteína N en las plantas. Éstas fueron “infectadas” por una versión modificada genéticamente del ARN del TMV que contenía las “instrucciones” para sintetizar la región C-terminal de la proteína N del SARS-COV2.

Proceso de producción del antígeno recombinante derivado de la mitad C-terminal de la nucleoproteína del SARS-CoV2 empleando plantas (N benthamiana) infectadas con TMV recombinante.

 

Después de comprobar que la N recombinante se estaba expresando correctamente en la planta, se purificó separándola de los componentes propios de las plantas, y se analizó su antigenicidad, es decir, su capacidad para ser reconocida por anticuerpos específicos. Para ello se desarrolló un ELISA indirecto empleando la proteína N recombinante obtenida en plantas como antígeno. Se probó con un extenso panel de muestras de sueros (procedente de estudios en colaboración con MADRID SALUD) cuya especificidad ya había sido determinada en un ensayo comercial. Para los análisis de los datos contamos con especialistas del Centro Nacional de Epidemiología-ISCIII/CIBERESP  y de MADRID SALUD. Como puede verse en la figura, la proteína N obtenida en plantas funcionó muy satisfactoriamente como antígeno en un inmunoensayo de detección de anticuerpos frente al SARS-COV2 (sensibilidad: 96.41%, especificidad: 96.37%).

Resultados del ELISA de anticuerpos frente a SARS-CoV2 desarrollado para probar la antigenicidad de la proteína N recombinante desarrollada en plantas.

 

El ELISA indirecto desarrollado para este trabajo es un formato muy básico de inmunoensayo. Hay diversas maneras de mejorarlo, y con ello mejorar aun más las cifras de sensibilidad/especificidad observadas. Lo importante era comprobar que la proteina recombinante producida en plantas es reconocida en inmunoensayo, como punto de partida para generar diversas aplicaciones relacionadas con el diagnóstico de esta enfermedad, que esperamso que vayan surgiendo en un futuro próximo.

En definitiva, un equipo interdisciplinar formado por virólogos (CISA/INIA-CSIC), biotecnólogos de plantas (CBGP/INIA-CSIC, AGRENVEC) y epidemiólogos (CNE-ISCIII; CIBERESP; MADRID SALUD) ha obtenido en plantas un antígeno útil y económico para el diagnóstico del SARS-COV2.

(NOTA: este post es una versión extendida y corregida de un hilo publicado en Twitter por la cuenta asociada a este blog: @Virusemergentes).

REFERENCIAS

Williams, L. et al (2021) The C-Terminal Half of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein, Industrially Produced in Plants, Is Valid as Antigen in COVID-19 Serological Tests. Frontiers in Plant Science. DOI: 10.3389/fpls.2021.699665.

Hoste, A.C.R. et al (2020). Two serological approaches for detection of antibodies to SARS-CoV-2 in different scenarios: a screening tool and a point-of-care test. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 98(4): 115167. DOI: https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2020.115167

 

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Nuevo coronavirus SARS-CoV-2: Los test diagnósticos y para qué sirve cada uno

Hace unos días escribí un hilo en Twitter comentando lo básico acerca de los métodos diagnósticos de COVID-19. El hilo ha tenido una gran repercusión, por lo que creo que puede ser útil reproducirlo en este blog.

 

Parece que hay cierta confusión con las técnicas de diagnóstico y vigilancia de #COVID19. Voy a intentar explicarlo un poco. Abro hilo

Conviene empezar explicando algunas cosas: por lo general hay dos tipos de tests, o pruebas de laboratorio:

  1. Las que detectan el patógeno, en este caso el virus, o elementos propios de éste, como su genoma.
  2. Las que detectan anticuerpos que reaccionan frente al virus.

Las primeras pueden ser virológicas (aislamiento en cultivo), antigénicas (detección de antígenos del virus) o moleculares (detección del genoma del virus). Las segundas se conocen como “pruebas serológicas” porque se basan en la detección de anticuerpos en suero.

Entre las primeras, las más empleadas son las moleculares, por lo que en adelante nos centremos en éstas. Las famosas “PCR” (reacción en cadena de la polimerasa) pertenecen a esta categoría. Hay muchas otras, pero las PCR presentan tantas ventajas que dominan en el diagnóstico.

Las segundas (serológicas) son muy variadas en forma, pero para lo que nos interesa aqui podemos distinguir dos: el ELISA y la IC (inmunocromatografía), ésta última es uno de los “tests rápidos” de los que tanto se habla.

Por cierto, “Test rápido” es una denominación poco afortunada: hay muchos tests “rápidos”, que emplean muchos formatos, y que sirven para detectar anticuerpos (son “serológicos”) o virus (concretamente antígeno vírico). Por ahora no nos metemos en este tema.

De momento quedémonos con esto:

  1. La PCR (y tests análogos) detectan genoma del virus, y por lo tanto INFECCIÓN ACTIVA.
  2. Las pruebas serológicas detectan ANTICUERPOS, y por lo tanto reacción inmune frente al virus. Detecta que el virus ha infectado al individuo muestreado.

Además, hay otra cosa importante que hay que saber: una PCR positiva no implica necesariamente que el indivíduo contagie. Para eso se necesita un virus INFECCIOSO. Una PCR positiva puede provenir de restos del virus, o de virus neutralizados por anticuerpos, que no infectan.

Y si no infectan, no contagian. En conclusión NO TODAS LAS PCR POSITIVAS CORRESPONDEN A UNA FASE CONTAGIOSA DE LA INFECCIÓN.

Esto puede verse en el esquema que he preparado al efecto para el COVID19, basado en datos de estudios reales (ver referencias al final):

Curso infección COVID19

Esta figura representa el curso de una infección leve por SARS-CoV-2. Por un lado, la línea azul representa la carga de ARN viral presente en muestra nasofaríngea. La parte de la curva que queda por encima del “umbral de infección” (carga viral “infecciosa”= carga necesaria para que se produzca un contagio) señala el período en que el indivíduo puede transmitir el virus a otras personas. Por otro lado, la línea roja representa la evolución de los anticuerpos totales en suero. Se distinguen 4 fases (números en círculo amarillo) en función del riesgo de transmisión. Combinando PCR y tests de anticuerpos es posible distinguir estas 4 fases (Fuente: elaboración propia sobre datos publicados: ver referencias al final del post)

En este esquema puede verse que empleando PCR y una técnica serológica podemos clasificar a los indivíduos en 4 categorías con diferentes niveles de riesgo de contagio: 1) naïve; 2) Infectados tempranos; 3) infectados tardíos y 4) recuperados. (ACLARACIÓN: este esquema representa a los casos leves o asintomáticos, los casos clínicamente más graves tienen otras consideraciones que no vamos a abordar en este hilo).

Los casos asintomáticos y leves tienen gran importancia epidemiológica, pues son los que más contribuyen a la transmisión del virus. La atención sanitaria se ha centrado mucho en los casos graves, pero el control de la pandemia pasa por controlar los asintomáticos y leves.

Por ello ahora cobra una importancia inusitada el empleo de los dos tipos de técnicas, serológicas y moleculares. Hay aún lagunas y cuestiones técnicas que resolver, pero está claro que tenemos que emplear ambas estrategias para controlar esta enfermedad.

Se me olvidó decir que el contagio se produce en una ventana concreta de la infección. varios estudios señalan que es desde 2 dias antes a aproximadamente una semana después del incio de los síntomas (en los casos leves).

 

Por último, algunas referencias de la bibliografía empleadas en este hilo:

Mizumoto, K. et al, (2020). Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Euro Surveill. 2020;25(10):pii=2000180.

Bai, Y., et al. Presumed Asymptomatic Carrier Transmission of COVID-19. JAMA (2020). https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.10.2000180.

Aguilar, J. et al. Investigating the Impact of Asymptomatic Carriers on COVID-19 Transmission medRxiv 2020.03.18.20037994; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.18.20037994

He, X. et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. medRxiv 2020.03.15.20036707; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.15.20036707.

Wölfel, R., Corman, V.M., Guggemos, W. et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x

Zhao, J.  Jr et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. medRxiv 2020 doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.02.200301895

Zhang, W. et al. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes, Emerging Microbes & Infections (2020) 9:1, 386-389, DOI: 10.1080/22221751.2020.1729071.

Wu LP, et al. Duration of antibody responses after severe acute respiratory syndrome. Emerg Infect Dis. 2007;13(10):1562–1564. doi:10.3201/eid1310.070576.

Bao, L. et al Reinfection could not occur in SARS-CoV-2 infected rhesus macaques. BioRxiv March, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.13.99022.Okba, N.M.A. et al. SARS-CoV-2 specific antibody responses in COVID-19 patients. MedRxiv, March 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.18.20038059.

Corman, V et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

 

 

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10º “EPIZONE Annual Meeting”, Madrid, 27-29 de septiembre de 2016

Se celebra esta semana en Madrid el 10º “EPIZONE Annual Meeting” (dias 27-29 de septiembre), y creo que este evento merece un post aqui, en el blog de los virus emergentes, por varias razones. La primera y principal, porque se trata de una reunión internacional que abordará los últimos avances científicos en materia de enfermedades epizoóticas causadas por virus, incluyendo zoonosis emergentes como la fiebre por virus West Nile (Nilo Occidental) o la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, por mencionar tan solo dos de las más conocidas por el público de este blog. La segunda, porque se organiza desde el Centro en el que trabajo, el Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), perteneciente al INIA, y de hecho formo parte del comité organizador, así que hablo con conocimiento de causa.

 

El grupo de investigación EPIZONE es una red internacional de laboratorios y centros de investigación sobre enfermedades epizoóticas con graves consecuencias para la sanidad animal, incluyendo zoonosis. Esta red está constituida por centros de investigación veterinaria de excelencia en el ambito europeo, y tiene un papel clave en la investigación sobre la prevención, detección y control de enfermedades animales y zoonosis para reducir el riesgo y mitigar los daños en la sanidad animal y la salud pública.

El grupo se reune una vez al año, y en estas reuniones abiertas participan grupos de investigación del área en todo el mundo, presentando los resultados de sus trabajos más recientes. Por las dimensiones de esta reunión, por su caracter abierto y por el modo en que se seleccionan las comunicaciones (mediante un comité científico en un proceso de revisión por pares), se puede decir que se trata de un congreso científico en toda regla.

La reunión ha ido ganando en importancia año a año, y para esta 10ª edición se esperan más de 200 participantes, procedentes de 24 países, la mayoría europeos, aunque algunos vienen de lugares tan lejanos como China, Corea del Sur o Australia.

Se presentarán 120 comunicaciones científicas que versarán sobre los cuatro vértices en que se articula la red EPIZONE: el diagnóstico, las vacunas y otras estrategias de intervención, la vigilancia y los estudios epidemiológicos, y el análisis de riesgo. Esta reunión se ha organizado además en tres áreas temáticas “concéntricas”:

  1. Sanidad animal en un mundo cambiante, donde se abordarán los avances en las enfermedades infecciosas emergentes y transfronterizas  de los animales y su adaptación y evolución en el contexto del cambio global. Aqui tendrán su espacio investigaciones sobre virus nuevos, o virus que han sufrido cambios en su distribución geográfica, rango de hospedador, patogenia, etc.
  2. Amenazas en las fronteras de Europa, donde se tratarán aquellas enfermedades que aún no están presentes en el territorio europeo pero existe un alto riesgo e entrada debido a su proximidad geográfica. Aqui tendrán cabida enfermedades que están extendiéndose rápidamente por los países próximos a Europa, como la fiebre aftosa, la peste de los pequeños rumiantes, la fiebre del valle del Rift o el síndrome respiratorio por Coronavirus de Oriente Medio.
  3. Retos actuales dentro de Europa, donde se discutirá acerca de aquellas enfermedades que ya han penetrado en Europa y están causando graves problemas, como la lengua azul, la peste porcina africana o la dermatosis nodular contagiosa.

(Puede consultarse el programa aqui)

Asisten a la reunión nueve conferenciantes invitados de gran prestigio internacional. Las conferencias que impartirán versarán, entre otros temas de interés, sobre el enfoque “Una salud”, la transmisión de zoonosis arbovíricas con hospedador aviar, las ultimas emergencias sanitarias en Turquía, los cambios asociados a los brotes recientes del virus de la fiebre aftosa, la situación a la que se enfrenta Europa con la peste porcina africana, la lengua azul, la dermatosis nodular contagiosa… Sin duda una buena puesta al día en epizootías víricas de la mayor actualidad en Europa.

Mención aparte merece el “Young EPIZONE”, o reunión previa que tienen los jóvenes investigadores de los grupos involucrados en la red EPIZONE, con un interesante programa diseñado y organizado por ellos mismos.

En definitiva, una interesante reunión científica que se celebra por primera vez en España, y es Madrid la ciudad elegida para ello, lo cual es posible porque uno de los centros miembros de la red EPIZONE, el CISA, está emplazado en Madrid.

Comentaremos las comunicaciones y conferencias desde la cuenta de twitter @virusemergentes, utilizando el hashtag #EpizoneMadrid2016.

Desde este blog de madri+d deseamos mucho éxito a la 10ª reunión anual EPIZONE.

 

 

 

 

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