El Instituto de Higiene Alfonso XIII nació debido a la necesidad de presentar una institución de carácter científico donde realizar investigaciones y avances de carácter sanitario en nuestro país, así como ya existían organismos semejantes en otros países europeos. Su primer director fue Santiago Ramón y Cajal (que en los inicios de su carrera científica había dudado si orientar su trabajo hacia la Microbiología o la Histología del sistema nervioso); a él se deben su estructura orgánica y el componente asistencial e investigador que el centro desarrollaría a lo largo de su historia. El nuevo centro dependía, en ausencia de una cartera ministerial específica de las cuestiones sanitarias, del Ministerio de Gobernación y de la Dirección General de Sanidad.
Entre sus especialidades figuraban la elaboración de vacunas, sueros, el análisis de muestras y la enseñanza e investigación microbiológica. El programa del Instituto incluía el desarrollo de tareas asistenciales, periciales, docentes e investigadoras, junto con la producción y control de calidad de sueros y vacunas.
Su presupuesto anual se construía a partir de la reasignación de los fondos destinados a las instituciones preexistentes, los ingresos procedentes de la enseñanza y análisis clínicos, la venta de sueros y vacunas elaboradas por la propia institución y los donativos y subvenciones que recibiera.
Inicialmente, el Instituto Nacional de Higiene se instaló de manera provisional en un local de la calle Ferraz, en 1899. En 1908 el ministro Juan de la Cierva concedió un crédito presupuestario de casi 600.000 pesetas para la construcción de un nuevo edificio en La Moncloa. La nueva sede del Instituto se levantó entre 1914 y 1915, en estilo neobarroco, por los arquitectos Leon Chifflot y Camile Lefebre. Se trataba de un gran caserón de cuatro plantas y dos patios interiores, dispuestos junto al cruce del Paseo de la Moncloa y la Carretera al Puente Nuevo, emplazado donde se encuentra actualmente el Rectorado de la Universidad Complutense. Había junto a él otros pabellones destinados al mantenimiento de los animales de los que se extraían los sueros y observaciones veterinarias.
En 1923 Cajal lo comparaba con los mejores establecimientos del extranjero. Al igual de lo sucedido con el Asilo Santa Cristina y el Instituto Rubio, el recinto del Instituto sufrió el efecto de la Guerra Civil; casi totalmente destruido, al finalizar ésta el edificio no fue reconstruido y sus funciones quedaron absorbidas por otras instituciones.
