Archivo de febrero, 2011

Células no tan madre…

Seguramente a estas alturas todos ustedes conocen mi pasión por las células madre. Células madre embrionarios, adultas, de cordón umbilical y, sobre todo, aquellas pluripotentes inducidas que parecen destinadas a gobernar las terapias futuras. Eso sí, siempre y cuando sean seguras…

El investigador japonés Shinya Yamanaka, de la Universidad de Kyoto y actual Premio Fundación BBVA Fronteras del Conocimiento, desarrolló hace unos años las prometedoras células iPS –células madre pluripotentes inducidas-. Mediante la inserción de varios genes –algunos potencialmente peligrosos- o directamente de sus proteínas codificantes, estas células pueden reprogramarse, convertirse casi en embrionarias y originar cualquier otro tipo celular. Sin embargo, no todo parece de color rosa…

Un equipo dirigido por Joseph Ecker, del Instituto Salk de California –con colaboración del padre de las células madre embrionarias James Thomson-, acaba de hacer público en Nature un problema inesperado. Células de la piel transformadas en pluripotentes no borraron todo su programa genético para adaptarlo a su nueva condición de pluripotencia. Algunos puntos del genoma –denominados “hotspots” o “puntos calientes” persistían tal y como estaban en la piel adulta.

Concretamente, los problemas detectados hacían referencia no ya a la secuencia del ADN en sí, sino a modificaciones posteriores importantes para la expresión de unos genes u otros: la epigenética. Analizando perfiles de metilación –un cambio frecuente en epigenética-, los científicos vieron que las células iPS no eran exactamente igual a las embrionarias, sino que mantenían zonas iguales a las de su origen epitelial, sobre todo en la zona próxima a los conocidos telómeros o centrómeros implicados en división celular…

El proceso de reprogramación es, por lo tanto, imperfecto y requiere de análisis más profundos antes de lanzar, en un futuro, las campanas al vuelo terapéutico.

JAL (CBMSO)

DIVULGACIÓN CIENTÍFICA A 21 DE FEBRERO DE 2011

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Identifican los sitios donde el genoma inicia su duplicación…

La existencia de los organismos vivos depende de que sus células se puedan dividir. El proceso de la división celular, básico para el crecimiento y el desarrollo de cualquier especie, requiere que todo su genoma se duplique antes de que pueda transmitir una copia a cada célula hija, algo que es absolutamente necesario para mantener la integridad del DNA de esa especie. Es como si una persona que posee un determinado capital y desea transmitir a sus dos descendientes esa misma cantidad necesita duplicarlo antes de poder repartirlo a partes iguales. 

Replicación del ADN

Replicación del ADN

El genoma de los organismos complejos es enorme; para hacernos una idea, en la planta Arabidopsis o en la mosca Drosophila, modelos experimentales comunes de plantas y animales, respectivamente, el genoma posee unos 120 millones de unidades, las bases del DNA que constituyen el llamado código genético. En el caso de las células humanas el genoma posee unas 3300 millones de unidades. Pero los hay incluso mucho mayores. 

Precisamente debido a su enorme tamaño, el genoma no se duplica empezando en un único lugar y progresa hasta completar la duplicación sino que se inicia en múltiples sitios repartidos a lo largo del genoma que se denominan orígenes de replicación. Identificar su localización y las características que los distinguen de otras regiones próximas que no funcionan como orígenes es un problema de gran dificultad. Sin embargo, su funcionamiento correcto es fundamental para la vida de la célula. 

Una investigación del CBMSO, centro mixto del CSIC y la UAM, ha permitido construir el mapa para localizar los orígenes de replicación del genoma, por primera vez en un organismo vegetal, la planta Arabidopsis thaliana, utilizada en el laboratorio como modelo experimental. En este estudio han participado también investigadores del CNB, y de las Universidades de California y de Georgia, en USA.

El incorrecto funcionamiento de los orígenes de replicación tiene consecuencias catastróficas para la célula ya que ocasiona que ciertas regiones del genoma no se dupliquen o lo hagan más de una vez en cada división celular, produciéndose ganancias o pérdidas de las mismas. Con ello se altera la integridad del genoma que en muchos casos contribuye a la transformación cancerígena de la célula.

Una vez identificados las posibles localizaciones en el genoma que pueden funcionar como orígenes de replicación cierta información de su entorno es la que parece determinar su actividad. En concreto, lo más importante parece ser la asociación de los orígenes de replicación con ciertas marcas epigenéticas -es decir aquellas modificaciones del DNA y de algunas proteínas asociadas que forman la cromatina-, y que no conllevan cambios en la secuencia del DNA (el código genético).

CBMSO (Cultura Científica)

DIVULGACIÓN CIENTÍFICA A 14 DE FEBRERO DE 2011

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Ingeniería de proteínas para mejorar la amplificación del DNA

Hoy en día numerosos estudios genómicos, filogenéticos, análisis epidemiológicos, diagnóstico clínico, medicina forense y muchos de los procedimientos de la biología molecular moderna dependen de la amplificación de cantidades limitantes de DNA, siendo un prerrequisito para un análisis genómico exitoso la disponibilidad de herramientas para la amplificación eficiente de secuencias de ácidos nucleicos.

Si bien la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es aún la metodología más utilizada en la amplificación de DNA, ésta depende de un conocimiento previo de las secuencias a amplificar, y genera amplicones relativamente pequeños. Muchos análisis genómicos dependen no solo de la longitud del material amplificado, sino también de una amplificación homogénea, por lo que son más ventajosas aquellas metodologías que permiten la amplificación eficiente y representativa de genomas completos, siendo la amplificación isotérmica por desplazamiento múltiple (MDA) la que está ganando terreno en el área de la amplificación de DNA. La MDA se lleva a cabo utilizando oligonucleótidos hexaméricos de secuencia al azar que hibridan en distintas regiones del genoma a amplificar y que son extendidos posteriormente por la DNA polimerasa (enzima que sintetiza DNA) del bacteriófago ø29, en una reacción isotérmica a 30 ºC, sin que se requieran ciclos de desnaturalización/renaturalización (a diferencia de la PCR), ni de un conocimiento previo de la secuencia (Figura 1). El éxito de MDA radica en las características intrínsecas y específicas de la DNA polimerasa de ø29:

1) Capacidad de polimerizar más de 100.000 nucleótidos (las unidades que se ensamblan para construir el DNA) sin disociarse del DNA.

2) Capacidad de atravesar regiones de doble cadena ya que el enzima acopla la síntesis del DNA a la apertura (desnaturalización) de las dos cadenas del DNA, haciendo innecesarios ciclos térmicos de desnaturalización.

3) Elevada fidelidad de síntesis del DNA (sólo un error cada 108-109 nucleótidos incorporados).

Esta metodología de amplificación se ha mostrado muy eficiente como paso previo a la secuenciación, para la caracterización de genomas virales desconocidos, para el genotipado de polimorfismos de nucleótido único, y recientemente para la descripción de nuevos metagenomas.

Figura 1

Figura 1

 Figura 1. Amplificación por desplazamiento múltiple con la DNA polimerasa de ø29. La DNA polimerasa (en esferas naranjas) puede comenzar simultáneamente la síntesis del DNA en múltiples sitios a los que se han hibridado al azar los hexámeros. Una vez alcanzado el hexámero que se encuentra delante, la síntesis continúa ya que la polimerasa abre esa región de cadena doble, dando lugar a “ramas” de cadena sencilla a las cuales se unirán nuevos hexámeros. Esta síntesis continua del DNA dará lugar a una amplificación isotérmica y exponencial del DNA.

 

Puesto que MDA es una alternativa más versátil y prometedora que PCR, el principal reto era la construcción de variantes de la DNA polimerasa de ø29 aún más eficientes en  amplificación de DNA. Debido a la complejidad estructural de las DNA polimerasas y a sus múltiples interacciones con los sustratos, la adquisición de nuevas propiedades requiere de grandes modificaciones estructurales, tarea difícil de abordar con mutaciones puntuales dirigidas a aminoácidos específicos. De hecho, hasta la fecha, las únicas mejoras en MDA se habían conseguido explorando diferentes modificaciones técnicas de los protocolos actuales.

En el trabajo publicado recientemente en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of USA los doctores Miguel de Vega y Margarita Salas, del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), se plantearon como objetivo conseguir variantes de la DNA polimerasa de ø29 que mostraran más afinidad por el DNA a amplificar que el enzima no modificado con el fin de aumentar la eficiencia de amplificación. Mediante técnicas de ingeniería de proteínas fusionaron al extremo C-terminal de la DNA polimerasa de ø29 dominios de unión inespecífica al DNA (Helix-hairpin-Helix; HhH) (Figura 2). Las DNA polimerasas quiméricas resultantes mostraron un incremento, respecto al enzima natural, en la capacidad de utilización de los hexámeros iniciadores,  implicando una mayor eficiencia de amplificación (vía MDA) de cantidades limitantes de DNA, tanto circular como genómico lineal, lo que representa una mejora sustancial en los protocolos de amplificación. Estas variantes de la DNA polimerasa de ø29 tienen aplicaciones potenciales en análisis genómicos, como estudios clínicos, forenses y antropológicos en los que las cantidades muy limitantes de DNA suponen una barrera para su amplificación y posterior estudio. Además, la alta fidelidad de inserción de nucleótidos y elevada procesividad de estas quimeras hace que puedan ser útiles en las tecnologías de secuenciación de tercera generación que actualmente se están desarrollando. La combinación de las DNA polimerasas quiméricas con la optimización de los protocolos  de reacción actuales contribuirán a hacer de las tecnologías de amplificación basadas en la DNA polimerasa de ø29 una de las herramientas más potentes en genómica.

Figura 2
Figura 2

Figura 2. Modelado de las DNA polimerasas quiméricas construidas. La figura representa el modelo estructural de un dominio (HhH)2 (en azul claro) unido a través de un péptido de unión al extremo C-terminal de la DNA polimerasa de ø29 (en morado)El interés biotecnológico de estas variantes creadas por ingeniería de proteínas ha quedado refrendado por la reciente concesión de la licencia de explotación de estas polimerasas por parte del CSIC a la empresa española de biotecnología XPol Biotech, SL para su pronta puesta en el mercado.

 

Este trabajo ha merecido una reseña en la revista Science-Business eXchange, del grupo Nature.

CBMSO

 

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