Whole Effluent Assessment

Este artículo es un resumen de guía práctica publicada por la comisión OSPAR para la establecer unas pautas que pretenden acercarse a la caracterización de los efluentes acuosos como un “todo” (Whole Effluent Assessment, WEA) en vez de la forma más clásica de identificar compuesto por compuesto (single substances approach).

Alice Luminita PETRE y Jose Antonio PERDIGÓN MELÓN

Departamento de Química Analítica e Ingeniería Química, UAH 

[Alice Luminita PETRE y Jose Antonio PERDIGÓN MELÓN. Departamento de Química Analítica e Ingeniería Química, UAH]

La OSPAR Commission “OSPAR Commission, protecting and conserving the North-East Atlantic and its resources” http://www.ospar.org/ fue creada en 1972 con el fin de incentivar la cooperación para la protección de la vida marina en el Atlántico Noreste. La comisión está formada por 15 países de Europa cuyas costas y vertidos pueden afectar a la zona del tratado. Los países firmantes son, Bélgica, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania, Islandia, Irlanda, Luxemburgo, Holanda, Noruega, Portugal, España, Suiza, Suecia y Reino Unido. Aunque Finlandia no pertenece a la costa oeste de Europa algunos de sus ríos fluyen Mar de Barent e históricamente ha estado involucrada en los esfuerzos para el control de vertidos de sustancias peligrosas en el mar del Norte y en el Océano Atlántico. Luxemburgo y Suiza son países firmantes por su influencia de sus vertidos sobre el rio Rhin.

Este artículo es un resumen de guía práctica publicada por la comisión OSPAR para la establecer unas pautas que pretenden acercarse a la caracterización de los efluentes acuosos como un “todo” (Whole Effluent Assessment – WEA) en vez de la forma más clásica de identificar compuesto por compuesto (single substances approach). El documento completo puede encontrarse en la dirección: http://www.ospar.org/documents/dbase/publications/p00316_WEA%20Guidance%20Document.pdf

El estudio clásico de los efluentes basados en el análisis de compuestos individuales es una estrategia usualmente utilizada por muchas de la normativas tanto de la propia OSPAR como por diferentes directivas de la Unión Europea como la Directiva Marco del agua (2000/860/CE) , el reglamento REACH (1907/2006) o la Directiva IPPC (European Integrated Pollution Prevention and Control 2008/1/CE). La estrategia de este acercamiento se basa en la determinación de la persistencia, bioacumulacion y toxicidad (PBT-criteria) de estas sustancias presentes en el efluente. Esos valores representan el riesgo medioambiental de cada sustancia y son usados posteriormente para determinar los parámetros de calidad del agua y los valores de emisión.

No obstante, a pesar de que este acercamiento mediante el estudio de sustancias individuales se considera eficaz se le reconocen algunos importantes defectos. En la actualidad se estima que en el mundo existen más de 50.000 sustancias distintas y aunque en la actualidad hay numerosos programas y estudios dedicados a la identificación y caracterización PBT de éstas, aun hay muchas sustancias por caracterizar. Además estos estudios solo se centran en las sustancias deliberadamente fabricadas, lo que implica que existen multitud de otras sustancias presentes en los efluentes y por tanto vertidas al medioambiente que nunca serán valoradas. Numerosos trabajos avalan el hecho de que un gran número de sustancias peligrosas que están presentes en los efluentes y aguas superficiales  no pueden ser detectadas, analizadas, identificadas y cuantificadas. Otro hecho demostrado es que este análisis individual de los distintos compuestos no tiene en cuenta el efecto que puede tener la mezcla de compuestos presente en la muestra medioambiental.

Estos problemas han hecho que aumente el interés por el desarrollo y aplicación de test para determinar PBT que puedan ser aplicados globalmente a toda la muestra en estudio ya sean efluentes, aguas superficiales o sedimentos. Estos estudios globales (denominados WEA de las siglas en ingles Whole Effluent Assessment) han sido aplicados en numerosos trabajos y se ha demostrado que las sustancias identificadas mediante métodos analíticos podrían explicar solo una pequeña porción de los efectos adversos que han sido medidos en las muestras. Esto significa que una gran fracción de los efectos adversos del agua, agua residual y sedimentos son causados por sustancias desconocidas (no identificadas) o por el efecto combinado de estas sustancias. Estos estudios sirven para aumentar el conocimiento de los efectos combinado de todas las sustancias conocidas y desconocidas presentes en los efluentes, especialmente en las mezclas complejas.

Las ventajas de concepto WEA ha llevado al desarrollo de este tipo de ensayos en todo el mundo y que algunos países como EEUU, Canadá, Alemania, Irlanda, España o Suecia, apliquen ya algunos test WEA en sus legislaciones o permisos de vertido. Así mismo dentro de la normativa IPPC el concepto WEA ha sido incluido en las estrategia de control de los efluentes en numerosas BREF (Best available technology Reference documents)  como en la de la producción de compuestos orgánicos a gran escala (2003) y en química fina (2006). En la mayoría de los países el reglamento de la aplicación de métodos WEA está restringido al estudio de la toxicidad aguda aunque se está pensando la introducción de otros parámetros.

La comisión creada por la OSPAR para el estudio de la aplicabilidad de métodos WEA se centro en tres aspectos.

A. Cuando aplicar WEA

B. Parámetros WEA a utilizar y orden

C. Test y protocolos WEA a aplicar

D. Aspecto prácticos. Manejo de las muestras, interpretación de resultados.

CUANDO APLICAR WEA

La gran ventaja de la aplicación de métodos WEA comparado con el de sustancia individuales es que se mide el efecto combinado de todas las sustancias presentes, incluidas aquellas desconocidas o de sustancias que aun no han sido determinadas. Cuanto mayor sea la complejidad de la muestra la caracterización mediante la identificación de compuestos individuales será más incompleta y puede resultar en la emisión de efectos adverso para las aguas superficiales. El grupo de trabajo de la OSPAR-WEA ha desarrollado cuatro criterios para seleccionar los efluentes donde la aplicación de los métodos puede tener su mayor interés

Industrias donde se prevea la presencia de efluentes complejo. Este criterio se basa en información de la planta considerando los productos empleados y los procesos utilizados responsables de la generación del  efluente, así como de los tratamientos que recibe el agua residual en la propia planta antes de su vertido.

Resultados previos de métodos WEA. Si los resultados de los ensayos WEA usados previamente muestran la presencia de efectos adversos en el medioambiente que no pueden ser explicados mediante el análisis de sustancias individuales. Es necesario comprobar si esos resultados fueron puntuales o se repiten en el tiempo.

Altos niveles de carbono orgánico total. Altos contenidos de carbón orgánico en el efluente indican la presencia de altos contenidos de sustancias orgánicas lo que significa que la probabilidad que el efluente pueda tener efecto adversos es más grande que en efluentes con bajo contenido en materia orgánica. De todas formas hay que tener en cuenta que la presencia de niveles bajos de materia orgánica en el efluente no es una garantía de la ausencia de efectos negativos; no hay un valor claro de corte para el COT o DQO ya que otros parámetros como puede ser la composición iónica, la presencia de metales tóxicos o compuestos orgánicos altamente tóxicos (aunque en baja concentración) como los pesticidas influyen en la toxicidad de la muestra.

Baja calidad ecológica de las aguas superficiales. Si el estado ecológico de las aguas superficiales es muy pobre una de las posibles causas  es la presencia de sustancias que causen efectos adversos en uno o más microorganismos lo que conlleva efectos a través de la cadena alimenticia que desequilibran el equilibrio ecológico. Los test WEA miden los efectos sobre los organismos y son un lazo de unión entre química y ecología. Los test WEA podrían ser aplicados a las aguas superficiales y a los efluentes para descartar esos que necesitan ser examinados en relación con el status ecológico.

B. QUE PARÁMETROS WEA UTILIZAR Y EN QUÉ ORDEN

Los parámetros más relevantes para el ambiente marino y que pueden causar efectos a largo tiempo son la persistencia, bioacumulación y la toxicidad crónica. De todas formas la toxicidad aguda debe ser estudiada en los efluentes para agua fresca, sobre todo en los primeros estudios de muestreo.

Otros parámetros de importancia en el ambiente marino son los disruptores endocrinos y sustancias con efecto mutagénicos. Estos parámetros están siendo determinados cada día con mayor frecuencia en las sustancias individuales. Estos test están aun en desarrollo y la relevancia de estos parámetros en el impacto medioambiental está bajo discusión.

Los ensayos WEA deben ser realizados en el orden persistencia, bioacumulación, y toxicidad. Es importante que los ensayos de persistencia no sean realizados como un parámetro separado si no en combinación con los otros parámetros. La secuencia comienza con los test de persistencia (test de degradación) para eliminar la mayoría de las sustancias no son persistentes. Después de este paso de pretratamiento la muestra tratada es usada para el estudio de la toxicidad y bioacumulación. Esta combinación de test revela los niveles de durabilidad de la toxicidad aguda, crónica y la bioacumulacion. Estos son considerados los más importantes ya que ocurre durante largos periodos de tiempo.

C. TEST Y PROTOCOLOS WEA A APLICAR

 Para la medida de cada parametro WEA existen diferentes ensayos y métodos en todo el mundo. Por ejemplo la toxicidad aguda con bacterias puede ser medida con diferentes especies de bacteria o pueden ser realizadas con distintos end-ponit o diferentes metodos. Cada metodo o ensayo tiene sus ventajas o relacion con el efecto del eflluente en el medioambiente, por lo tanto es necesario disponer de un conjunto de herramientas con una variedad de ensayos para cada parametro WEA a analizar que se adapte especificamente al efluente y a las agua superficiales receptoras del vertido.

Estas herramientas se pueden dividir en dos grupos i) aquellas que son generalmente aceptads, usadas y aplicadas  en el mundo y que son las más robustas y estan mejor desarrollads y ii) aquellas que contienen metodos menos aceptados y menos desarrollados pero pueden ser utiles para ocasiones especificas o que pueden ser apliacdas en un futuro próximo tras un periodo de desarrollo.

C-1 Breve descripción de los ensayos:

Toxicidad aguda. La toxicidad aguda es el parámetro más ampliamente usado y desarrollado y sobre el que existe el mayor número de protocolos disponibles. Muchos países aplican test de bacterias algas y crustáceos prácticamente usando el mismo organismo y protocolo. También existen test que utilizan peces pero son menos utilizados por razones éticas y económicas. Dentro de estos ensayos hay test con organismos de agua dulce y con organismos marinos. Los efluentes pueden tener un carácter salino, salobre o dulce y a su vez pueden ser vertidos en sistemas marinos, salobres o de agua dulce. Idealmente el organismo utilizado debería estar en concordancia con el agua receptora, es decir utilizar organismos de agua dulce si el efluente se descarga en sistemas de agua dulce o organismos de agua salada si el efluente vierte en agua saladas. Cuando la naturaleza del efluente es diferente de la del agua receptora es necesario hacer una elección, también si el efluente es alterado antes de su vertido (adicción de salinidad al agua fresca para efluentes que descarguen en el mar).  La tabla 1 extraída de la guía de la OSPAR-WEA resume estos test así como los países que los utilizan.

Toxicidad crónica. Los ensayos de toxicidad crónica son mucho menos comunes que los de toxicidad aguda. La comisión realizó un estudio y encontró hasta 15 ensayos distintos de los cuales 9 estaban estandarizados con norma ISO. Los organismos utilizados pertenecían a la familia de las bacterias, algas, crustáceos, rotíferos, biválvulas, echinodermata, peces y plantas. El tiempo de exposición varía desde las 16 horas hasta los 90 días dependiendo del ciclo de vida del organismo. La mayoría de los test utilizan como medida la inhibición del crecimiento siendo la mayoría ensayos estáticos y solo un 30% son semiestáticos. Respecto a la naturaleza de estos, 9 pueden ser aplicados a aguas frescas y 7 a aguas salobres. La tabla siguiente extraída de la guía de la OSPR-WEA resume estos ensayos:

Bioacumulación. Para los ensayos de bioacumulación existen dos test. El método LLE aplicado en Suecia de forma rutinaria y se basa en la extracción total de sustancias potencialmente bio acumulables incluida la fracción unida a las materia particulada, y el método SPME este método es más reciente y refleja más precisamente la posible bioacumulación en el ecosistema y solo mide sustancias biológicamente disponibles. La tabla, extraída del documento de la OSPR-WEA resume estos ensayos.

Genotoxicidad y mutagésis. Existen diversos métodos internacionalmente estandarizados para la medida de estos parámetros. La genotoxicidad mide cualquier daño potencial sobre el material genético, mientras que la mutagénesis tiene en cuenta daños permanentes y transmisibles en el material genético.

 Disruptores endocrinos. Estos test son menos utilizados y están menos estandarizados que los de mutagénesis y varían de país en país. Generalmente son utilizados en programas de I+D y suelen ser ensayos in vitro con células humanas o levadura modificadas y en algunos casos utilizan pez cebra.

Persistencia. La medida de la persistencia es un parámetro complicado, como es bien sabido de los estudios mediante compuestos individuales. Aunque para la determinación de la persistencia se usa principalmente la biodegradación existen otros factores como hidrólisis que pueden afectar la persistencia de los productos químicos. Una de las dificultades es que la persistencia está definida de forma general tiempo de vida media, mientras que en realidad la persistencia representa un gradiente variando desde sustancias fácilmente degradables (no persistentes) sustancias difícilmente degradables (persistentes o no persistentes) y sustancias no degradables (persistentes). Estos test simulan diferentes condiciones de degradación, adsorción y/o reacciones químicas que se pueden dar en los sistemas naturales, para obtener información de los diferentes niveles de persistencia. La tabla siguiente, extraída del documento de la OPRS-WEA resume estos ensayos:

D. ASPECTOS PRÁCTICOS

D-1 Manejo y almacenamiento de las muestras

Existen numerosos documentos y normas que tratan sobre las técnicas de muestreo y manejo de las muestras de agua. Entre ellas las más importantes son:

• ISO 5667-2:1991. Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques

• ISO 5667-3: 2003. Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of water samples

• ISO 5667-16: 1998. Water quality – Sampling Part 16: Guidance on biotesting of samples

La toma de muestras es considerado el paso más delicado en los procesos de análisis de efluentes porque los errores no pueden ser corregidos. Normalmente los ensayos rutinarios toman las muestras justo antes de ser vertidas (end-pipe), no obstante si se quiere determinar el origen del efecto medioambiental el análisis de muestras en procesos intermedios puede ser de gran utilidad. La utilización de muestreadores automáticos proporcionales suele ser la mejor elección. Normalmente las muestras compuestas tomadas en 2 o 24 horas son más representativas que las muestras tomadas manualmente de forma aleatoria. Si la toma de muestras ocurre durante periodos largos de tiempo (por ejemplo 24 horas) éstas deben ser refrigeradas. El material de sistema de recogida debe ser químicamente inerte, fácil de limpiar y resistente a los procesos de calentamiento y congelado. Los materiales recomendados son vidrio, polietileno o politetrafluoruroetano. Las muestras almacenadas  entre 0 y 5 ° C en la oscuridad son estables durante 24 h. Si las muestras se congelan por debajo de – 18 °C se puede alargar el periodo de conservación preferiblemente hasta 2 semanas y como máximo dos meses según la norma ISO 5667-16. Es conocido que los procesos de congelación y descongelación de la muestras pueden (pero no siempre) resultar en una pérdida de toxicidad. Si el proceso de descongelación no se hace de forma controlada los compuestos volátiles se pueden eliminar. Así mismo estos procesos pueden alterar el tamaño y distribución de las partículas afectando a otros ensayos posteriores. Si las partículas en suspensión sedimentan puede ocurrir una significativa reducción de la toxicidad, por lo que si se cree que éstas pueden tener una fuerte contribución a la toxicidad deben realizarse ensayos que no se vean afectados por su presencia.

El principal objetivo de los pretratamientos es que las muestras se parezcan a la inicial tanto como sea posible y modificarla lo mínimo que requiera el test a realizar. Algunas ideas sobre cómo conseguir esto son:

a) Las muestras congeladas deben ser descongeladas inmediatamente antes de su uso. Hay que asegurar que la muestra es homogeneizada bien agitando o sacudiendo la muestra para evitar sobrecalentamientos donde la pérdida parcial de compuestos volátiles debe ser considerada.

b) En general los bioensayos deben ser realizados con la muestra original. En algunos casos las partículas pueden afectar al comportamiento de los organismos o a los sistemas de detección (p.e. fotometría) En estos casos un paso previo de eliminación de estas está permitido. De todas formas los procesos de eliminación de las partículas llevan el riesgo de que los compuestos activos adsorbidos a las partículas son también eliminados previamente a la realización del test. El primer paso recomendado sería dejar sedimentar las partículas de 30 minutos a 2 horas. Si las partículas no se eliminan por sedimentación la centrifugación es preferida a la filtración. Si la filtración es necesaria deben usarse filtros de fibra de vidrio.

c) Los ensayos de degradabilidad de las aguas residuales deben realizarse preferiblemente con las muestras sin diluir para asegurar que los sucesivos ensayos de toxicidad no se vean afectados por la dilución. Si es necesario diluir las muestra (p.e. niveles de COT muy altos) el factor de dilución debe ser tenido en cuenta a la hora de interpretar los resultados.

d) Las muestras que tengan pH extremos excediendo los límites de tolerancia de los microorganismos deben ser neutralizados. Este paso debe ser omitido si el efecto del pH quiere ser reflejado en la toxicidad o si el ajuste del pH puede provocar reacciones químicas o físicas (p.e precipitación). Los volúmenes de acido o bases utilizados deben se tales que el cambio de volumen sea lo menor posible. Como agentes neutralizantes se puede utilizar acido clorhídrico y hidróxido sódico.

e) La toxicidad de algunas sustancias (p.e. amoniaco, sulfuros, cianuros, aminas, fenoles y ácidos orgánicos) se ve afectada por el pH. La dependencia de la toxicidad del amoniaco con el pH es muy remarcable en los estudios con peces. En los bioensayos con algas se observa un aumento del pH debido a que el CO₂ es consumido. El pH debería ser medido y registrado durante el ensayo para una correcta interpretación de los resultados. En ciertos casos se debería considerar el ajuste del pH o la utilización de tampones.

f) La presencia de nutrientes en el efluente podría favorecer el crecimiento en los ensayos con algas o plantas. La presencia de organismos en las muestras podría interferir con el organismo del ensayo mediante efectos fisiológicos o biológicos. (p.e. consumo de oxigeno por bacterias, eliminación de algas o bacteria por los protozoos, infección del organismo del ensayo)

g) La presencia de partículas podría afectar con las medidas de fluorescencia en los ensayos con la bacteria Vibrio fischeri, pueden reducir el crecimiento del alga por generación de zonas de sombra y molestar los sistemas de filtración en daphnia o la agallas de los peces.

h) La absorción de luz puede reducir el crecimiento de algas e interferir con las medidas fotométricas y de luminiscencia.

D-2 Expresión e interpretación de los ensayos de toxicidad

En los ensayos WEA los resultados de toxicidad pueden ser expresados de diferentes maneras y existen diferentes normativas oficiales:

• Guidance on statistically evaluation gives OECD (2006) and ISO (2004)

• ISO/PDTS 20281: 2004 (draft). Water quality – Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data.

• ECETOC. Whole Effluent Assessment. Technical Report No. 94, Brussels, December 2004

• OECD. Current approaches in the statistically analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. OECD Series on testing and assessment No. 54, 09-May-2006

Umbral de concentraciones (NOEC/LID). Se conoce como NOEC (de las siglas en ingles No Observed Effect Concentration) el volumen de muestra (en %) que no tiene estadísticamente efectos adversos significativos. Aunque este valor es muy utilizado en los ensayos de toxicidad aguda, NOEC es usado más frecuentemente para expresar los efectos en la toxicidad crónica. Para este tipo de medida no es necesario establecer una relación dosis-respuesta. Otro valor utilizado es el LID (Lowest Ineffective Dilution) que es comparable a NOEC. Se define como el inverso de la fracción de volumen de la muestra de agua residual a la cual no se observan efectos adversos que excedan le variabilidad del especifica del ensayo (ISO 5667-16: 1998 Annex A).

Curvas concentración-respuesta (EC50, EC10, LC50) La ECi se define como la concentración de una sustancia en un medio que se espera produzca un cierto efecto en el i% de los organismos testeados de una población bajo ciertas condiciones (IUPAC, 1993). La LC50 representa la concentración del compuesto tóxico que resulta letal para el 50% de los organismos expuestos durante un período especificado. Estos valores se pueden determinar grafica- o estadísticamente. Se prefiere utilizar métodos estadísticos Los valores de EC50 o LC50 se calculan normalmente a partir de curva dosis – respuesta.

Unidades de toxicidad KLa unidades de toxicidad aguda TU_a se define como 100/EC50. En ensayos de toxicidad crónica la unidad de toxicidad TUc se define como 100/NOEC. Los datos de toxicidad crónica se corresponden con el LID (LID = 1/fracción de volumen; TUc = 100/NOEC = LID. Por ejemplo si NOEC se corresponde con un 25 % volumen del efluente LID = 1/0.25 = 4; TUc = 100/25 = 4).