En Química Agrícola y en Nutrición, al N se le reconoce un rango de elemento esencial para todos los seres vivos.  Ello se debe a que desde la Bioquímica, la Genética y largo etc de materias relacionadas, éste elemento está presente en todas las moléculas que son esenciales para conformarse, actuar, multiplicarse y funcionar. Así al N se le encuentra en moléculas energéticas como el ATP o responsables del potencial reductor, como el NAD(P), en organizaciones moleculares como las proteínas, las clorofilas, las glico-proteínas o los ácidos nucléicos y funcionalmente, en las estructuras enzimática, de sostén, genéticas, de inmuno-reconocimiento o de captura de luz.  Hasta moléculas tan sencillas como el NxO, en microcantidades, actúa como un micro-regulador de la actividad mitótica de las células hepáticas, hecho que facilita la recuperación del hígado, en un órgano tan importante para los animales y en las personas que castigan al hígado por causas varias (incluido el botellón). 

Si abióticamente abundaron los aminoácidos, las bases púricas y pirimidínicas, los pirroles o los aminoazúcares, es lógico que este elemento se fuera integrando en los conjuntos que conformaron los primeros seres vivientes. Pero… ¿de donde sale este N? 

Como hoy, en la atmósfera, el N₂ es un gas muy poco reactivo que abundaba (pozo depósito por excelencia), pero, para integrarse en una molécula orgánica, tenía que adquirir una forma reducida. Conseguirlo era y es una tarea complicada y energéticamente muy costosa:

Industrialmente se puede hacer reducir industrialmente mediante la síntesis de Haber-Bosch y se consigue en presencia de H₂, a una temperatura de entre 200 y 500 ºC y una presión de entre 200 y 1000 atmósferas, en presencia de catalizadores inorgánicos Fe₃O₄/Al₂O₃.  Todo un caudal de Energía pues el mundo fabrica mas de 50 millones de toneladas año para integrarlo en los fertilizantes, lo que hay que tener en cuenta cuando nos hablan de la agroenergética.

Naturalmente, cuando la atmósfera era extraordinariamente reductora y rica en metano y H₂ las descargas eléctricas y un gran aporte de energía radiante del ámbito del ultravioleta junto a un elevado régimen térmico facilitaron el desarrollo del proceso. Claro que en estas circunstancias uno de los compuestos mas abundantes sería el ácido cianhídrico. Esto promocionó el incremento del número de carbonos de los azúcares simples (qué contento se podrá Kiliani al mencionar su síntesis, aunque no se consiguió por parte de aquella biología incipiente integrar compuestos de mas de 7 carbonos), pero casa mal con las cadenas de transferencia electrónica, tal y como hoy las conocemos (el HCN es un extraordinario inhibidor del conjunto citocromo a-a₃, capaz de reducir al O₂ generando H₂O).  La verdad es que en los seres vivos también han evolucionada estas cadenas redóx. Y es que en otra época existían las cadenas de oxido-reducción CN^– resistentes…, pero esto es otra historia.

A los que les gusta del metabolismo recordarán no sin sorpresa, que las plantas todavía manejan abundantemente los CN^–, como un recuerdo de su metabolismo histórico, y si no revisen ese metabolismo en las almendras amargas, y el de la rizosfera…, verán, verán.

En la historia de la evolución, amanece, muy al principio un conjunto molecular, de extraordinario interés, que vino a suplir a la actividad reductora abiótica del N₂. Su nombre, NITROGENASA. Hoy su trabajo es capaz de reducir hasta 175 millones de toneladas de N / año, sin costo alguno para las reservas energéticas de la Tierra. Tomen nota nuestros dirigentes, porque algunos países, donde se cree que conservar los suelos es algo importante, tomaron medidas hace bastantes años desde la óptica de los que viene a llamarse “tecnologías intermedias”, que en muchos casos se encuentran enfrentadas a los intereses de las empresas de fertilizantes inorgánicos y a la que me referiré al final del post.

Un análisis de la reducción del N (fijación biológica de nitrógeno) de una forma desacoplada aunque completa, precisa dar 4 pasos:

1º.  Un sistema Ferredoxín oxidorreductasa ubicado en una cadena de oxidación de materiales orgánicos, capta los electrones de una sustancia orgánica.  Hablamos inicialmente de un ser quimiotrofo. La ferredoxina contienen un núcleo “mejor llamarlo Clúster para homologar el nombre con la Bioinorgánica” denominado “Fe₄S₄” capaz de aceptar electrones desde una molécula orgánica o inorgánica y reenviar electrones a otro clúster, “acoplado”.  En situaciones evolutivas más avanzadas los electrones pueden proceder directamente del flujo fotosintético (cianobacterias).

2º. Un sistema “Fe proteína” ubicado en el complejo I de la dinitrogenasa (ahora le llamamos “clúster P” y contienen un núcleo “Fe₄S₄”) capta esos electrones. Además este complejo I acepta e hidroliza Mg²⁺ATP (dos moléculas por cada e^– que fluye) e incorporando la energía de enlace el “sistema de fijación” de nitrógeno.

3º.  Electrones, energía y N₂ entran en el complejo II de la dinitrogenasa donde hay otra proteína con un clúster distinto “Mo/Fe” (se llama dinitrogenasa reductasa) con un clustrer Fe₈S₈ y un segundo clúster que actúa como cofactor “Fe₇MoS₈”) que con todo lo anterior (electrones y energía) y H⁺ externos, reduce el N₂ hasta NH₄⁺.  En muchos seres vivos, el excedente generado de NH₄⁺ (que no usa su metabolismo) se libera al medio externo.

4º. Un soporte orgánico de 5 átomos de C (el ácido glutámico) preexistente y otro (el a-cetoglutarato) sintetizado a partir de otra vía metabólica, (en la que influye directamente la tasa de CO₂ del medio externo), recoge el amonio gracias a un sistema enzimático, denominado GS/GOGAT (glutamín sintetasa/glutamín-a-cetoglutarato amino-transferasa), que permite circular al N reducido de una forma no tóxica para el bacterioide y para el huésped (en su caso).

Para los que les interesa conocer un poco mas de su bioquímica, les contaré que:

• este proceso de reducción del N presenta una variación de energía libre de – 65,6 kJ/mol.
• la Fe-proteína del complejo I de esta dinitrogenasa es un homodímero (a₂). En la primera unidad se capta el Mg²⁺ATP, y en la segunda de las sub-unidades actúa hidrolizándole.
• Evolutivamente el clúster de Fe-S como el de la ferredoxina del complejo I, capaces de transferir electrones, ha sufrido un proceso de evolución verdaderamente interesante dado que cada tipo de clúster trabaja a un potencial redox distinto:
• Así conocemos que la rubredoxina (Clostridium pasteurianun) presenta un clúster “Fe₁S_O” , trabaja una potencial de oxidorreducción entre –50 y +50 mv a pH 7. siendo el clúster FeS mas antiguo que se conoce.
• La aconitasa, enzima de suma importancia en los ciclos de Krebs (aerobios) y de Evans (anaerobios), contiene un clúster del tipo “Fe₃S₃” .
• las ferredoxinas (Fd) presentan tres variantes (en la bacteria S. Platenis “Fe₂S₂” que trabaja entre 300-400 mv, en la Termophilus marítima (TmFd) y en el Bacillus thermoproteilyticus (BtFd) se conforman con clúster “Fe₄S₄”) que trabaja a –645 mv y en el Disulfovibrius africanus (DaFd) aparece un clúster “Fe₃S₄” que oxidorreduce a –446 mv.

Ello conlleva una selectividad de las especies respecto al medio en el que viven

Además nos encontramos con otros clúster más complejos consecuencia de dimerizaciones:

• El clostridium pasteurianun presenta un clúster Fe₈ S₈ cuya ferredoxina se conoce como PaFd cuya potencialidad de reducirse puede alcanzar los –400 mv.
• El Azotobacter vineilandii presenta un clúster Fe₇S₈ cuya ferredoxina se conoce como AvFd y el Sulfolobus , con una S₇Fe₈ denominada SfFd. 

En el aspecto evolutivo no solo tiene importancia la conformación de estos núcleos metálicos por lo general con una tendencia conformacional cúbica. Además debe de incluirse la complejidad de la proteina en la que se encuentra incluida, que modula el potencial redox y la carga a la que funcionan los núcleos y cuyas modificaciones han ido acompañando a las distintas especies biológicas en las que se ha incluido la nitrogenasa.  Así nos encontramos una, algo especial, capaz de trabajar en medios con un potencial positivo de +350 mV. Por este hecho se denomina “HiPIP o «Fe-S» proteína de alto potencial”, encontrada en el Chromatium vinosum.

Estas proteínas que envuelven a los distintos núcleos Fe-S no solo condicionan el citado potencial del clúster. Además establecen los lugares de ocupación del cofactor, y condicionan, por su reactividad con otros iones como son los distintos fluoruros de aluminio.

• El cofactor, denominado FeMoCo, que ayuda a mantener al N₂ sobre el centro activo de la dinitrogenasa reductasa, no es el único, además nos encontramos con un FeVCo y el ZnFeCo.  Estos cofactores son muy sensibles a la contaminación iónica de la solución del suelo o del agua, en zonas pantanosas. Y el mercurio, empleado por los buscadores de oro, es un ión especialmente dañino.  No debemos de olvidar que muchos de los componentes de los bosques tropicales son leguminosas leñosas. 

Este conjunto, molecular capaz de fijar Nitrógeno hoy nos le encontramos integrado en muchos seres vivos, desde bacterias intestinales (en termitas) hasta en plantas (leguminosas), pasando por otras asociaciones como los líquenes, en los que la bacteria (microalga) además de la capacidad fotosintética presenta la de fijación de Nitrógeno.  Quienes poseen esta capacidad asociada y compleja, son autónomos con respecto al N externo presente en el suelo, pero no hay que olvidar que este es un delicado sistema bioquímico que presenta muchas variantes evolutivas, que está presente en bacterias libres y muchas plantas no lo poseen, y que, por lógica está sometido a muchos sistemas de control de su actividad.

Pero siguiendo un orden de presentación no debemos de olvidar, en primer lugar, la factura energética del proceso. Así, y aunque no está totalmente claro este coste veamos alguna propuesta estequimétrica referidas únicamente a los tres primeros pasos:

N2 + (6+2n)H+ + (6+2n) e– + p(6+2n)ATP  à  2NH3 + nH2 + p(6+2n)ADP + p(6+2n)Pi

Donde n: número de moléculas de H2 formadas (1 ó 2, desconocido) y

p: número de ATP requeridos por electrón transferido (probablemente 2).

Pero este conjunto enzimático no es perfecto, o quizás debiéramos decir que es versátil, dado que es capaz de:

• Unir iones hidrógeno, generando H2
• Aceptar diferentes moléculas que contienen un triple enlace, presentes en la atmósfera o en la solución del suelo, lo que genera compuestos varios.  Las mas conocidas son:

nitrógeno NºN              que produce     NH₃ + NH₃,

acetileno HCºCH           que produce     H₂C=CH₂

cianuros HCºN              que produce     CH₄ + NH₃

Cianderivados RCºN      que produce     RCH₃ + NH₃

Azidas H-N–N+ºN        que produce     N₂ + NH₄⁺

Óxido nitroso NºN+-O- que produce     N₂ + H₂O

Isocianuros R-N⁺ºC- R   que produce    NH₂ + CH₄

Por otro lado, la actividad complejo Nitrogenasa está regulado, debido a que:

• Requiere Mg2+ (que toma del suelo) y ATP (abundantes) y una gran fuente de electrones. Estos últimos los obtienen del uso de la sacarosa en las plantas superiores incluidas las de interés agrario.  Por ello, conocer este hecho es de suma importancia en el cultivo de la caña de azúcar, a la hora de aportar abonos en el momento adecuado, tanto más cuanto el exceso de ión amonio (NH₄⁺) en el suelo reprime la síntesis de la dinitrogenasa reductasa y el resto de los constituyentes protéicos del conjunto Nitrogenasa.
• El proceso sufre también una inhibición competitiva con el H₂ que también genera la dinitrogenasa reductasa por exceso de acidez de la solución del suelo.
• La dinitrogenasa reductasa se inhibe con altas concentraciones de ADP (señal de falta de energía).
• El conjunto se desnaturaliza por O₂ libre. De aquí la importancia del estudio de las leghemoglobinas, capaces de captar, en el interior del bacterioide, las moléculas de Oxígeno, una a una, llevándolas hasta el punto terminal de la cadena redox actual propio del bacterioide.   Esta circunstancia hace que deba de ser regulada la presencia de O₂ en el suelo por exceso (mucho cuidado con la intensidad de las labores del suelo) y por defecto, ya que suelos encharcados también afectan al desarrollo de la planta y a la conservación integral de los conjuntos radiculares (los medios anóxicos facilitan la putrefacción fúngica de las raíces).
• Se inhibe por CO (monóxido de carbono) lo que obliga a controlar otro proceso del suelo “la oxidación del NH₄⁺” también llamado nitrificación, que realiza un elevado consumo de O₂ y facilitando la aparición de CO por un un defecto temporal de O2, lo que conduce a deficiente oxidación del Carbono. 

Para ver el impacto que tiene sobre el suelo el cultivo de plantas fijadoras de nitrógeno, veamos algunos resultados, a los que me refería al principio del post, como políticas no solo de producción, sino de conservación del N del suelo como un recurso, alternativas al uso de fertilizantes inorgánicos:

Tasas de Fijación de biológica cultivando plantas simbióticas.

• Alfalfa (Rhizobium  meliloti)                                150-200 Kg/Ha
• Clover (Rhizobium Trifolii)                                  100-150 Kg/Ha
• Soja (Rhizobium japonicum)                                  50-100  Kg/Ha
• Lupino (Rhizobium lupini)                                      50-100  Kg/Ha
• Alubia (Rhizobium Phaseoli)                                  30- 50  Kg/Ha 

Aunque también este conocimiento tiene otra vertiente de interés, a la hora de ahorrar aportes de N como fertilizantes. Algunos estados como la India, con el apoyo de instituciones internacionales, recomiendan el cultivo de especies libres fijadoras de N, que el gobierno distribuye gratuitamente en forma liofilizada, y que una vez multipicado en charcas “ad hoc” el agricultor extiende al resto del suelo, tras una estrategia de multiplicación, sencilla y compatible con sus labores habituales.  De ahí la importancia de extender el conocimiento del cultivo de microalgas que recomendaba días pasados en forma alternativa o quizás complementaria, a la consecución de “biopetróleo”….

Especies libres

• Azotobacter y Clostridium                                         5-20 Kg/Ha
• Cianobacterias (algas verde azuladas)                         10-50 Kg/Ha

Seguiré informando, en la medida en que el “sistema” me lo permita.

Saludos cordiales,

Salvador González Carcedo